Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
SOLUBILITA’
CARICA ELETTRICA
AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE
L'invenzione della cromatografia viene attribuita
al biochimico russo Mikhail Cvet che riuscì, nel
1906, a separare la clorofilla da un estratto
vegetale.
Con il termine cromatografia oggi si indicano
tutte le varie tecniche separative e/o analitiche
che si basano sulla distribuzione fra due fasi:
una fase stazionaria (fissa) ed una mobile
che passa attraverso la fase stazionaria.
Il coefficiente di partizione o di distribuzione
(Kd) definisce come un composto si distribuisce
tra due fasi non miscibili.
Date due fasi non miscibili A e B, il valore di
questo coefficiente ad una data temperatura è
costante ed è rappresentato dalla seguente
espressione:
[campione] nella fase A
Kd =
[campione] nella fase B
 In linea generale, tutti i sistemi cromatografici
consistono di una fase stazionaria immobilizzata
(solida, gel, liquida, o una miscela solido/liquido)
e di una fase mobile (liquida o gassosa)
 Il campione, costituito da una miscela di molecole,
è miscelato alla fase mobile ed è fatto fluire
attraverso la fase stazionaria
 Le fasi mobile e stazionaria devono essere scelte
in modo tale che i composti da separare siano
caratterizzati da coefficienti di distribuzione
differenti
 E’ il metodo cromatografico maggiormente
adoperato
 La fase stazionaria è immobilizzata su una
matrice adatta (un supporto inerte ed
insolubile) ed impaccata all’interno di una
colonna di vetro o di metallo
 La fase mobile liquida è fatta passare nella
colonna per gravità, tramite un sistema di
pompe, oppure applicando gas sotto
pressione
Kd = 1
5 cm
La colonna, di altezza pari a 5 cm, è riempita con una fase
stazionaria solida e circondata da una fase mobile liquida
(1 cm3 per cm di colonna).
Sono applicati 32 mg di un certo composto disciolti in
1 cm3 di fase mobile.
Quando questo volume passa ad occupare la posizione A,
1 cm3 di fase mobile uscirà dalla base della colonna.
Kd = 1
5 cm
Se un altro cm3 di fase mobile viene introdotto in colonna, la fase mobile che
era in A si sposterà in B, portando con sé 16 mg di composto e lasciandone
una quantità uguale in A (stadio 2).
Sia in A che in B, però, si avrà una ridistribuzione del composto tale che
ci saranno 8 mg nella fase stazionaria ed 8 mg nella fase mobile.
Aggiunte ulteriori della medesima quantità di fase mobile daranno le
distribuzioni mostrate negli stadi 3, 4 e 5.
Dopo un numero relativamente basso di equilibramenti, il composto si
distribuisce simmetricamente a formare una banda.
Le colonne cromatografiche possono immaginarsi costituite da
un certo numero di zone adiacenti in ognuna delle quali
c’è spazio a sufficienza affinchè il soluto raggiunga un
completo equilibramento tra fase mobile e stazionaria
Ecco come il numero di piatti teorici influenza la distribuzione
di un soluto con coefficiente di distribuzione pari ad 1
Un picco ben risolto non
è l’equivalente di una
sostanza pura
A parità di volume di fase
stazionaria, colonne più lunghe e
strette determinano una separazione
migliore (risoluzione) di proteine
simili.
Quando l’analita si muove in colonna, esso si distribuisce in una
banda che presenta una distribuzione gaussiana
In alcuni casi, però, il picco risulta asimmetrico, mostrando un allargamento sia
della parte iniziale sia della parte finale (tailing)
L’asimmetria dei picchi può essere dovuta a numerosi fattori
Il caricamento in colonna
di concentrazioni troppo
elevate di analita
L’imperfetto impaccamento
della colonna
La presenza di
interazioni
soluto-supporto
Un’applicazione del
campione mal eseguita
 Colonna
 Serbatoio per la fase mobile
 Dispositivo che consente l’identificazione degli analiti a mano
a mano che essi lasciano la colonna nell’eluato
 Registratore
 Raccoglitore di frazioni
La cromatografia liquida su colonna si divide in diversi
tipi a seconda della pressione generata all’interno
del dispositivo durante il processo di separazione
 Cromatografia liquida a bassa pressione (LPLC: low pressure liquid chromatography):
le pressioni sono inferiori ai 5 bar (1 bar = 0.1 MPa) poiché la resistenza opposta dalla
fase stazionaria (per la sua natura fisica) al flusso della fase mobile è minima
 Cromatografia liquida a media pressione (MPLC: medium pressure liquid chromatography):
si generano pressioni tra 6 e 50 bar
 Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC: high pressure liquid chromatography): si
lavora con pressioni superiori ai 50 bar
Nella pratica le differenze tra MPLC ed HPLC sono insignificanti e vengono adoperate le
stesse apparecchiature e procedure.
Entrambe le tecniche forniscono un eccellente grado di risoluzione, per cui si preferisce
definirle con il termine di cromatografia liquida ad alta risoluzione.
Tempo di ritenzione (tR): tempo impiegato da ciascun analita per emergere dalla colonna
Volume di eluizione o ritenzione (VR): volume di fase mobile richiesto per eluire l’analita
I due parametri sono in relazione l’uno con l’altro tramite la velocità di flusso (Fc) della
fase mobile in colonna:
VR = tRFc
La velocità di flusso dipende dalle dimensioni della colonna (diametro interno, lunghezza),
dalle caratteristiche fisiche delle particelle che compongono la fase stazionaria (dimensioni,
forma, porosità) e dalla viscosità della fase mobile.