Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
SOLUBILITA’
CARICA ELETTRICA
AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE
L'invenzione della cromatografia viene attribuita
al biochimico russo Mikhail Cvet che riuscì, nel
1906, a separare la clorofilla da un estratto
vegetale.
Con il termine cromatografia oggi si indicano
tutte le varie tecniche separative e/o analitiche
che si basano sulla distribuzione fra due fasi:
una fase stazionaria (fissa) ed una mobile
che passa attraverso la fase stazionaria.
CROMATOGRAFIA
Qualitativa
Metodica separativa
Quantitativa
Preparativa
Cromatografia
liquida
Gas
Cromatografia
Proteine
Peptidi
Acidi nucleici
Biomolecole
Vitamine e cofattori
Carboidrati
Lipidi
Ogni singola molecola è contraddistinta
da sue proprie e peculiari caratteristiche:
Peso molecolare (ingombro sterico)
Presenza/assenza di gruppi ionizzabili
Presenza/assenza di regioni idrofobiche
Struttura tridimensionale
Solubilità in determinati solventi
…
E’ il metodo cromatografico maggiormente
adoperato
La fase stazionaria è immobilizzata su una
matrice adatta (un supporto inerte ed
insolubile) ed impaccata all’interno di una
colonna di vetro o di metallo
La fase mobile liquida è fatta passare nella
colonna per gravità, tramite un sistema di
pompe, oppure applicando gas sotto
pressione
Metodica Separativa
I costituenti di una miscela vengono separati attraverso il passaggio in una colonna
cromatografica…
Colonna cromatografica
FASE
MOBILE
FASE
STAZIONARIA
M
Ripartizione delle molecole tra le due fasi
FASE
MOBILE
FASE
STAZIONARIA
M
Cosa determina la ripartizione tra le due fasi?
1) Le interazioni che si stabiliscono fra le molecole e le due fasi
INTERAZIONI di TIPO NON COVALENTE
Legami idrogeno
Interazioni elettrostatiche
Forze di van der Waals
Interazioni idrofobiche
2) L’accessibilità differenziale alla fase stazionaria
Dimensioni delle molecole
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi
FASE
MOBILE
FASE
STAZIONARIA
M1
M2
Perché e quando due molecole si separano?
Perché le interazioni e/o l’accessibilità della molecola M1 con le due fasi
(STAZIONARIA e MOBILE) sono diverse rispetto a quelle della molecola M2
FASE
MOBILE
FASE
STAZIONARIA
COO-
COO- COO
COO
COO- COO
Gruppi carbossilici immobilizzati
(pKa: 4)
PRGKKRGK
5+ / 1-
GGILVFTEDD
1+ / 4H2O con tampone fosfato pH 7.4
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi
Coefficiente di Distribuzione (K)
K = [M]s / [M]m
Nelle condizioni indicate precedentemente si può ritenere che:
PRGKKRGK => K > 1 – alta “affinità” per la fase stazionaria
GGILVFTEDD => K < 1 – bassa “affinità per la fase stazionaria
GK
KKR
PRG
COO- COO COO
COO
COO- COO
Gruppi carbossilici immobilizzati
(pKa: 4)
GGILVFTEDD
H2O con tampone fosfato pH 7.4
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi
Coefficiente di Distribuzione (K)
K = [M]s / [M]m
FISSO nel TEMPO
Sistema cromatografico fisso nel tempo
FASE MOBILE e FASE STAZIONARIA
non cambiano
VARIABILE nel TEMPO
Sistema cromatografico variabile nel tempo
FASE MOBILE e FASE STAZIONARIA
cambiano
CROMATOGRAFIA di TIPO
ISOCRATICA
IN GRADIENTE
L’entità delle interazioni che si stabiliscono tra le fase mobile e stazionaria e le molecole
Rimangono invariate nel tempo
Si modificano nel tempo
K = [M]s/[M]m =1
Equilibrio
Fase MOBILE
Spostamento
Equilibrio
Spostamento
Equilibrio
Fase STAZIONARIA
tempo
K = [M]s/[M]m =1
FM
FS
FM
FS
K = [M]s/[M]m =4
Quantità assoluta
I
II
III
IV
V
I
II
III
IV
V
Quantità assoluta
Le molecole si separano grazie a differenze nella loro K
K=4
Separazione
K=1
Le colonne cromatografiche possono immaginarsi costituite da
un certo numero di zone adiacenti in ognuna delle quali
c’è spazio a sufficienza affinchè il soluto raggiunga un
completo equilibramento tra fase mobile e stazionaria
Ecco come il numero di piatti teorici influenza la distribuzione
di un soluto con coefficiente di distribuzione pari ad 1
Un picco ben risolto non
è l’equivalente di una
sostanza pura
A parità di volume di fase
stazionaria, colonne più lunghe e
strette determinano una separazione
migliore (risoluzione) di proteine
simili.
Quando l’analita si muove in colonna, esso si distribuisce in una
banda che presenta una distribuzione gaussiana
In alcuni casi, però, il picco risulta asimmetrico, mostrando un allargamento sia
della parte iniziale sia della parte finale (tailing)
L’asimmetria dei picchi può essere dovuta a numerosi fattori
Il caricamento in colonna
di concentrazioni troppo
elevate di analita
L’imperfetto impaccamento
della colonna
La presenza di
interazioni
soluto-supporto
Un’applicazione del
campione mal eseguita
Colonna
Serbatoio per la fase mobile
Dispositivo che consente l’identificazione degli analiti a mano
a mano che essi lasciano la colonna nell’eluato
Registratore
Raccoglitore di frazioni
La cromatografia liquida su colonna si divide in diversi
tipi a seconda della pressione generata all’interno
del dispositivo durante il processo di separazione
Cromatografia liquida a bassa pressione (LPLC: low pressure liquid chromatography):
le pressioni sono inferiori ai 5 bar (1 bar = 0.1 MPa) poiché la resistenza opposta dalla
fase stazionaria (per la sua natura fisica) al flusso della fase mobile è minima
Cromatografia liquida a media pressione (MPLC: medium pressure liquid chromatography):
si generano pressioni tra 6 e 50 bar
Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC: high pressure liquid chromatography): si
lavora con pressioni superiori ai 50 bar
Nella pratica le differenze tra MPLC ed HPLC sono insignificanti e vengono adoperate le
stesse apparecchiature e procedure.
Entrambe le tecniche forniscono un eccellente grado di risoluzione, per cui si preferisce
definirle con il termine di cromatografia liquida ad alta risoluzione.
Tempo di ritenzione (tR): tempo impiegato da ciascun analita per emergere dalla colonna
Volume di eluizione o ritenzione (VR): volume di fase mobile richiesto per eluire l’analita
I due parametri sono in relazione l’uno con l’altro tramite la velocità di flusso (Fc) della
fase mobile in colonna:
VR = tRFc
La velocità di flusso dipende dalle dimensioni della colonna (diametro interno, lunghezza),
dalle caratteristiche fisiche delle particelle che compongono la fase stazionaria (dimensioni,
forma, porosità) e dalla viscosità della fase mobile.
Generalmente si assume che l’area sottesa da ciascun picco sia proporzionale
alla quantità dell’analita corrispondente che è stato eluito
L’area del picco può essere calcolata
misurandone l’altezza (hp) e la sua
larghezza a metà dell’altezza (whA).
Il prodotto di queste due dimensioni si
assume essere pari all’area del picco.
In alternativa, si può ritagliare il picco
dalla carta del registratore e pesarlo,
assumendo che area e peso
siano linearmente correlati.
I calcoli sono più efficacemente
eseguiti da integratori appositi
Matrici utilizzate
SUPPORTO INERTE PER LA
FASE STAZIONARIA
Agarosio Polisaccaride cosituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-Lgalattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose, Superose, Bio-Gel A
Limiti di esclusione 10-40000 kDa
Cellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unite da legami β-1,4 (legami crociati
tramite epicloridrina)
Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami β-1,6. E’ presente in
commercio con il nome di Sephadex (legami crociati tramite epicloridrina). Limiti di
esclusione 0.7-800 kDa. Il Sephacryl e’ costituito da destrano che forma legami crociati
con N,N’-metilene bisacrilammide. Limiti di esclusione 1-8000 kDa. Il Superdex e’ un gel
composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio.
Poliacrilammide Polimero di acrilammide e N,N’-metilenbisacrilammide. Disponibile
in commercio come Bio-Gel P, limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kDa
Polistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene
Silice Polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (SiOH) rendono la matrice altamente idrofilica
IMPACCAMENTO DELLA FASE
STAZIONARIA IN COLONNA
Viene di norma eseguito introducendo con delicatezza in colonna (avendo cura di
tenere chiusa l’uscita) una sospensione della fase stazionaria nella fase mobile
Nel corso dell’impaccamento è necessario agitare la parte superiore della sospensione
e/o tappare la colonna per assicurare che non rimangano bolle d’aria nella fase
stazionaria
La sospensione di fase stazionaria è versata in colonna fino a quando non viene
raggiunta l’altezza desiderata
A tal punto la colonna è messa in flusso con fase mobile aprendone l’uscita sino a
completo impaccamento
E’ opportuno posizionare sulla superficie della colonna un dispositivo di protezione
adeguato, come un filtro di carta o una garza di nylon
Nessuna parte della colonna deve essere lasciata andare a secco
Un impaccamento insufficiente produce un flusso irregolare in colonna (channeling) ed
una minore risoluzione
CARICAMENTO DEL CAMPIONE
Si rimuove dalla superficie della resina la maggior parte della fase mobile, aspirandola,
e facendo flussare il rimanente in colonna. Il campione è poi applicato con una pipetta
e fatto entrare in colonna. Un volume minimo di fase mobile serve infine a lavare le
pareti della colonna dall’eventuale residuo di campione rimasto. Un volume più cospicuo
di fase mobile è stratificato sulla superficie della colonna.
In alternativa, la densità del campione può essere incrementata aggiungendovi
saccarosio in concentrazione 1% circa. Quando questa soluzione è stratificata sul liquido
che ricopre il letto della colonna, automaticamente si disporrà sul fondo ed entrerà
rapidamente in colonna. La metodica è valida solo se il saccarosio non interferisce con la
successiva separazione ed analisi del campione.
Un terzo metodo prevede l’utilizzo di un tubo capillare e/o una siringa, oppure una
pompa peristaltica per portare direttamente il campione sulla superficie della colonna.
SVILUPPO DELLA COLONNA
I componenti contenuti nel campione caricato sono separati l’uno dall’altro
dal passaggio del solvente (fase mobile) nella colonna.
E’ fondamentale che l’eluizione avvenga a velocità costante, ciò che è
facilmente raggiunto eluendo per gravità.
POMPE PERISTALTICHE
Le pompe più comuni utilizzano tubi di silicone, polivinilcloruro o fluoruro che,
compressi a velocità costante da un disco rotante, rilasciano la fase mobile con
la velocità di flusso desiderata.
Le pompe ed i tubi, di diametro noto, devono essere preventivamente tarati per
determinare la velocità di flusso.
ELUIZIONE ISOCRATICA
Sviluppo della colonna con
l’utilizzo di un solo solvente
ELUIZIONE IN GRADIENTE
Si operano variazioni continue di pH, concentrazione
o polarità
SISTEMI DI RIVELAZIONE
La rivelazione può basarsi sull’assorbimento nella zona dell’ultravioletto, sulla
spettroscopia a fluorescenza, su variazioni dell’indice di rifrazione,
sull’emissione di radioattività.
I sistemi di rivelazione più comuni registrano l’assorbimento di luce
nell’ultravioletto. Gli strumenti migliori rivelano le proteine nell’intervallo 190 –
220 nm e 260 – 280 nm.
RACCOGLITORI DI FRAZIONI
Funzionano in modo tale da riempire ogni provetta con una certa quantità di
eluato, prima di passare automaticamente a quella successiva.
La quantità di eluato raccolta in ogni provetta può essere regolata in vario
modo.
Si può utilizzare un sistema di sifoni che convoglia un determinato volume,
oppure un dispositivo elettronico che controlla il numero di gocce di eluato
che cadono nella provetta.
Una possibilità ulteriore di raccolta è quella ad intervalli fissi di tempo.
Se varia la composizione
dell’eluato, varia anche la
tensione superficiale e la
dimensione delle goccioline
Se varia la velocità di flusso
in colonna, varia anche il volume
delle frazioni; in realtà ciò si
verifica di rado e quindi i
raccoglitori a tempo fisso sono i
più utilizzati
CROMATOGRAFIA
Gel-filtrazione
Scambio ionico
Affinità
Fase inversa
FASE STAZIONARIA
solida-porosa
FASE MOBILE
liquida
solidagruppi carichi
liquida
solidaligando immobilizzato
liquida
liquida
liquida/
gassosa
Consente la separazione di molecole in base alle loro dimensioni
Il termine gel filtrazione è, infatti, impiegato per descrivere la separazione di
molecole di dimensioni diverse utilizzando gel (composti organici polimerici che
possiedono una rete tridimensionale di pori che conferisce loro le proprietà di
un gel)
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
solida – porosa
liquida
Nessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proteine
Le particelle di resina fungono da setacci molecolari
SI DISTRIBUIRANNO TRA LA FASE MOBILE
ALL’
ALL’INTERNO ED ALL’
ALL’ESTERNO DEL SETACCIO
MOLECOLARE E TRANSITERANNO IN COLONNA
CON UNA VELOCITA’
VELOCITA’ INFERIORE
SARANNO COMPLETAMENTE ESCLUSE
DAI PORI E QUINDI PASSERANNO ATTRAVERSO
GLI SPAZI INTERSTIZIALI E COMPARIRANNO
PER PRIME NELL’
NELL’ELUATO
Concentrazione proteica totale
Attività Specifica
N° della frazione
(o volume dell’eluato)
Se una molecola di analita è grande e perciò completamente esclusa dalla fase
mobile presente all’interno del gel, il suo Kd è pari a 0, mentre se l’analita è
sufficientemente piccolo da avere completo accesso alla fase mobile interna, il suo
Kd è pari a 1
A causa della variabilità delle dimensioni dei pori tra le particelle di gel, solo una
parte della fase mobile interna sarà accessibile agli analiti di dimensioni intermedie;
quindi i loro valori di Kd variano tra 0 e 1
Ciò rende possibile la separazione su un determinato gel di analiti in un intervallo di
dimensioni estremamente ristretto
Nome commerciale
Sephadex
Bio-Gel
Sepharose
Polimero
Intervallo di
frazionamento (kDa)
G-10
Destrano
0.05 - 0.7
G-25
Destrano
1-5
G-50
Destrano
1 - 30
G-100
Destrano
4 - 150
G-200
Destrano
5 - 600
P-2
Poliacrilammide
0.1 - 1.8
P-6
Poliacrilammide
1-6
P-10
Poliacrilammide
1.5 - 20
P-30
Poliacrilammide
2.4 - 40
P-100
Poliacrilammide
5 - 100
P-300
Poliacrilammide
60 - 400
6B
Agarosio
10 - 4000
4B
Agarosio
60 - 20000
2B
Agarosio
70 - 40000
logPM
Volume di eluizione
Le colonne Sephadex G-25 possono essere utilizzate per dissalare
soluzioni di composti ad alto peso molecolare
Le sostanze ad alto peso molecolare sono escluse dai pori, mentre
i composti a basso peso molecolare si muovono lentamente
Tale metodo è adoperato per allontanare l’ammonio solfato da
preparazioni proteiche ed i sali dai campioni eluiti dopo
cromatografia a scambio ionico
VANTAGGI
• Semplice nell’esecuzione
• Prevedibile
• Eluizione nel tampone di partenza
SVANTAGGI
• Bassa capacità (piccoli volumi, 1/40
del volume della colonna)
• Sovrapposizione dei picchi
• Diluizione del campione
Cellule di E. coli contenenti la RNasi A
Lisi mediante ultrasuoni
(sonicazione)
Omogenato cellulare
Centrifugazione
(eliminazione detriti cellulari)
Sopranatante dell’omogenato cellulare
contenente la RNasi A
Sopranatante dell’omogenato cellulare
Cromatografia per gel filtrazione
Resina SEPHADEX G-75
capacità di separazione 5-70 KDa
Destrano: polimero di residui di glucosio uniti da legami β-1,6
che presenta legami crociati con epicloridrina.
Limiti di esclusione 0.7-800 kDa.
Pompa
peristaltica
Colonna
Collettore di frazioni
CONDIZIONI SPERIMENTALI
Volume della resina: 12 ml
Soluzione tampone: Tris-Acetato 0,1 M, pH 8,4, contenente NaCl 0,3 M
Campione di carico (miscela di 4 proteine):
1. RNasi A (PM = 13.7 kDa)
2. α-amilasi (PM = 50 kDa)
3. Emoglobina da plasma bovino (PM = 64 kDa) (4 subunità da 16 kDa)
4. Albumina da siero bovino (PM = 69 kDa)
Volume del campione di carico = 0,3 ml
Volume delle frazioni = 0,4 ml
Determinazione dell’assorbanza nell’ultravioletto (λ = 278 nm)
di tutte le frazioni ottenute
Riportando in grafico i valori di assorbanza in funzione del
numero delle frazioni (o del volume eluito) si ottiene il
cromatogramma
Cromatogramma gruppo PLR
Assorbanza a 278 nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
N° frazioni
Cromatogramma Gaito-Pennacchio -Procentese
Assorbanza a 278 nm
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
0
5
10
15
N°frazioni
20
25
30
35
Cromatogramma Capuano
Assorbanza a 278 nm
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
20
21
23
25
27
29
31
33
-0,1
N° frazioni
Cromatogramma C.L.
Assorbanza a 278 nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
N° frazioni
Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
CARICA ELETTRICA
•
Le molecole cariche interagiscono con gruppi funzionali
presenti sulla fase stazionaria
•
La forza del legame proteina-matrice dipende dalla carica
netta della proteina
•
La separazione si basa sulle differenze di carica netta (per
valori di pH definiti) delle diverse proteine
•
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
•
Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa,
destrano ed agarosio
solida – gruppi carichi
liquida
Si basa sull’attrazione elettrostatica esistente tra
proteine cariche e GRUPPI IONICI di carica
opposta presenti sulla MATRICE
Scambiatore cationico
Scambiatore anionico
Il meccanismo dello scambio ionico è definito in termini di
cinque passaggi distinti:
Diffusione dello ione sulla superficie di scambio
Diffusione dello ione all’interno della matrice fino al sito di scambio
Scambio degli ioni al sito di scambio
Diffusione dello ione che è stato scambiato sulla superficie dello scambiatore
Distacco selettivo della molecola di interesse
1. Variazioni di pH e/o di forza ionica
2. Eluizione per affinità → è introdotto nel sistema uno ione che presenta
affinità maggiore per lo scambiatore rispetto allo ione legato
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
Scambiatore
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
-
-
-
-
-
-
-
Scambiatore
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
-
-
-
-
CENTRIFUGAZIONE
-
Scambiatore
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
-
-
- -
-
-
Soluzione di lavaggio
-
-
-
- -
-
-
Soluzione salina concentrata
-
-
-
- -
-
-
Eluizione
-
-
-
-
-
-
-
_ _
_ _
_
_
R-CH2-COOR-CH2-COO-
+
+
+ +
+
+
R-CH2-COOR-CH2
_ _
_ _
_
_
-COO-
R-CH2-COOR-CH2-COO-
+
+
+
ClNa+
R-CH2-COOR-CH2-COOR-CH2-COO-
Na+
Na+
Cl-
+
+
+ +
+
+
Cl- Na+
Na+
Cl-
R-CH2-COO-
Na+
Na+
R-CH2-COOR-CH2-COO-
Cl-
+
+
Cl+
Cl-
Na+
Cl-
Na+
Na+
Na+
R-CH2
-COO-
Na+
R-CH2-COO- Na+
R-CH2-COO- Na+
R-CH2-COO- Na+
Cl-
Na+
Cl-
Cl-
R-CH2-COO- Na+
Cl-
R-CH2-COO- Na+
ClCl-
Na+
Na+
Cl-
Na+
Cl-
+
+
+ +
+
+
Cl-
ClCl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cromatografia in batch
-
-
-
-
-
-
-
Cromatografia su COLONNA
[SALE]
[SALE]
Effetti del pH sulla resina scambiatrice
Gruppo CARBOSSIMETILICO
scambiatore debole di cationi
R-CH2-COOH
=
R-CH2-COO-
pKa ~ 4.5
Gruppo PROPILSOLFONICO
scambiatore forte di cationi
R-CH2-CH2-CH2-SO3H = R-CH2-CH2-CH2-SO3pKa < 1
Effetti del pH sulla resina scambiatrice
Gruppo amminico terziario
scambiatore debole di anioni
R
|
R-CH2-N:
|
R
=
R
|
R-CH2-NH+
|
R
pKa ~ 8.5
Ammina quaternaria
scambiatore forte di anioni
R
|
R-CH2-N+-R
|
R
Effetti del pH sulla carica delle molecole proteiche
pI = 5.5
Proteinan+
Proteinan-
4
7
10
pH
Effetti del pH sulla carica delle molecole proteiche
pI = 8.5
Proteinan+
4
Proteinan7
10
pH
Si definisce capacità totale di scambio il numero di milliequivalenti di ioni
scambiabili, riferito ai grammi di scambiatore secco o all’unità di volume
della resina idratata
Elettroliti deboli, i quali sono ionizzati a valori estremi di pH, potranno
essere separati solo su scambiatori forti, in grado di operare in un
ampio intervallo di pH
Per gli elettroliti forti si preferisce ricorrere a scambiatori deboli, i quali non
sono in grado di legare le impurità fornite di carica presenti nel
campione e possiedono caratteristiche di eluizione migliori
Il pH del tampone adoperato deve essere di almeno una unità inferiore o
superiore al punto isoionico dei composti da separare
•
Scambiatore cationico forte
•
pH 1-2 (tutti gli aa si legano)
•
Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica:
1.
2.
3.
•
aa acidi (es. aspartato e glutammato)
aa neutri (es. glicina e valina)
aa basici (es. lisina e arginina)
Rivelazione tramite ninidrina
VANTAGGI
• Possibilità di caricare grandi volumi
• Eluizione della proteina di interesse in un piccolo volume
SVANTAGGI
• Esecuzione in due tempi
• Eluizione in un tampone a pH e forza ionica diversi dal
tampone iniziale
• Possibilità di selezionare solo molecole ionizzabili
Determinazione della concentrazione proteica
mediante METODO DI BRADFORD
Il colorante Coomassie® Brilliant Blue G-250 nella sua
forma libera presenta un massimo di assorbimento a 465
nm (marrone) → il legame alle proteine determina uno
spostamento del massimo di assorbimento del colorante a
595 nm (blu)
La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla
quantità di proteine presenti nel campione in esame
L’incremento di assorbanza a 595 nm (intensità del colore
blu) è proporzionale alla concentrazione proteica
COSTRUZIONE DI UNA RETTA DI TARATURA
Proteina a concentrazione nota (BSA)
Colorante (Bradford)
1 mg/ml
2 mg/ml
4 mg/ml
8 mg/ml
16 mg/ml
Camp. H20 Camp.
µl
µl
Bianco 500
Bradford
µl
Abs 595 nm
M
--
500
0,423 0,453 0,438
∆
1
499
1
500
0,598 0,639 0,619 0,181
2
498
2
500
0,68
4
496
4
500
0,796 0,811 0,804 0,366
8
492
8
500
1,001 0,998 1,000
0,684 0,682 0,244
0,56
µg/ml
y = 0,0511 x
0,45
Assorbanza a 595 nm
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
2
4
µ g di proteina
6
8
Camp.
H20
µl
Bianco
500
1
499
2
Camp.
µl
Bradford
µl
Abs 595 nm
M
∆
500
0,423 0,453 0,438
1
500
0,598 0,639 0,619 0,181
498
2
500
0,68
4
496
4
500
0,796 0,811 0,804 0,366
8
492
8
500
1,001 0,998 1,000
pool
490
10
500
#1
490
10
500
#2
490
10
500
#3
490
10
500
#4
490
10
500
0,684 0,682 0,244
0,56
µg/µ
µl
Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
CARICA ELETTRICA
AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE
Si basa sulla specificità delle interazioni biologiche per ottenere la
separazione e la purificazione delle molecole
Un ligando specifico per la molecola di interesse è legato
covalentemente ad una matrice insolubile
E’ necessario che le molecole da isolare siano in grado di legare il
ligando in maniera specifica e reversibile
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
solida – ligando immobilizzato
liquida
• Deve possedere un numero sufficiente di gruppi chimici, ai quali
possa essere legato covalentemente lo specifico ligando
• Deve essere stabile nelle condizioni di legame e durante la
successiva eluizione
• Deve interagire solo debolmente con le altre macromolecole,
riducendo così al minimo l’adsorbimento aspecifico
• Le matrici più utilizzate sono i destrani (Sephacryl S), agarosio
(Sepharose, Bio-Gel A), poliacrilammide (Bio-Gel P), polistirene
(Bio-Beads S), cellulosa
Per evitare che il legame del ligando alla matrice possa interferire con la sua capacità
di legarsi poi alla macromolecola, è preferibile interporre un braccio spaziatore tra
ligando e matrice
La sua lunghezza è critica per l’efficienza della cromatografia (la lunghezza ottimale è
tra 6 e 8 atomi di carbonio):
1) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il ligando e la molecola da
purificare
2) Se troppo lungo può instaurare interazioni idrofobiche con le molecole
proteiche
GENERICO: un ligando che mostri una selettività di gruppo, dal momento che
è in grado di legare gruppi affini di molecole che possiedono una
similarità chimica insita molto ampia, ad es. poly-(U) per mRNA
SPECIFICO: un ligando che sia in grado di legare in maniera specifica una
data molecola, ad es. un analogo di un substrato per purificare
un enzima o ioni nickel per code di istidina
Legame di un ligando al braccio spaziatore
legato alla matrice
L’immobilizzazione può provocare l’inattivazione del ligando perché ne
altera la struttura tridimensionale o rende inaccessibile il sito di legame
NON SPECIFICA:
si basa su variazioni di pH, della forza ionica o
sull’aggiunta di un agente denaturante
SPECIFICA:
si aggiunge un competitore, vale a dire un composto
che ha una maggiore affinità per la molecola da
purificare rispetto al ligando legato covalentemente
alla matrice
CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
per purificare una ribonucleasi
pirimidina
Analogo del substrato
legato covalentemente
alla resina
o aggiunta del
competitore
VANTAGGI
• Possibilità di caricare grandi volumi
• Eluizione del composto di interesse in un piccolo volume
• Elevata specificità di selezione
SVANTAGGI
• Esecuzione in più tempi
• Richiesta conoscenza delle caratteristiche della molecola
da selezionare (meccanismo d’azione, affinità per altri
ligandi, ...)
• Eluizione in un tampone a pH e/o forza ionica diversi dal
tampone iniziale
• In molti casi il campione eluito è contaminato dall’agente
“spiazzante”
Cromatografia per interazione idrofobica
• PRINCIPIO: sfrutta l’idrofobicità superficiale
delle proteine (residui Aa. non polari)
• FASE STAZIONARIA: matrice inerte a cui
sono legati gruppi idrofobici (radicali o gruppi
ottilici, fenilici, butilici
• FASE MOBILE tampone polare
– A concentrazione salina decrescente (riduzione degli
effetti idrofobici)
– A concentrazione di detergente crescente
– Con variazione di pH
Cromatografia di ripartizione
• Fase diretta
• fase stazionaria: polare,
• eluente apolare
• Fase inversa
• fase stazionaria apolare,
• eluente polare
Si – O – C18H37
Cromatografia liquido-solido o in
fase normale
FASE STAZIONARIA:
Matrice di silica, allumina,
fasi legate a GRUPPI
amino-, ciano-, o fenilici
FASE MOBILE NON
POLARE
Come esano, isopropanolo
• Eccellente per analiti non
polari,isomeri,
separazione in gruppi
omogenei in polarità
Cromatografia in fase inversa
Separazione basata sulla ripartizione
• dell’analita in una fase stazionaria
• idrofobica legata a gel di silice
• FASE MOBILE polare come
miscele di metanolo/acetonitrile e
acqua;
• Analiti polari eluiscono prima
mentre i non polari sono più
ritenuti
• Modo HPLC più comune
•
Per analiti polari (solubili in
acqua), di media polarità, e
talvolta non-polari
Interazione idrofobica
• ELUIZIONE:
• gradiente discendente di forza ionica
• Gradiente ascendente di solventi organici
(alcoli)
• In alcuni casi il legame è così forte che
si devono usare detergenti
• UTILE PER LA SEPARAZIONE DI PROTEINE
DI MEMBRANA
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
• Elevato numero di piatti teorici
• Ridotta dimensione delle particelle di
matrice
• Elevata pressione della colonna
Colonne per HPLC
Pressione fino a 55 MPa (550 Bar)