L.S. in Scienze e tecnologie alimentari
Anno Accademico 2008/2009
Corso integrato:
Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU)
Modulo:
Chimica analitica strumentale (4 CFU)
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA
TEORIA GENERALE
(CAS-2)
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA
(Tswett’s writing = Tswett’s analysis)
… ma chi è Tswett ?
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA
(chromos = colore + graphos = scrittura mediante il colore)
PER I PIU’ CURIOSI:
Mikhail Semynovich Tswett (1872-1919)
Karlo Ivanovich
Sakodynskii:”Michael
Tswett:
life russo,
and work”.
Nasce
ad Asti (Italia) il 14 maggio 1872,
da Siméon,
e Maria de
Derozza,L’8
italiana.
a Losanna,
poi all’Università di Ginevra,
mar Studia
Carlo Erba Edizioni,
Milano
(gratuito,
a
richiesta)
dove si laurea in Scienze nel 1896, discutendo una tesi sulla struttura
delle cellule vegetali (protoplasmi e cloroplasti). Nello stesso anno si
trasferisce a San Pietroburgo, ma in Russia non gli è riconosciuto il
titolo di studio svizzero e pertanto nel 1901 sostiene una nuova tesi
di laurea dal titolo “Struttura fisico-chimica della particella di clorofilla.
Studio sperimentale e critico”. Nel 1901 si trasferisce a Varsavia, in
qualità di assistente presso il Dipartimento di Anatomia e Fisiologia
Vegetale, per divenire poi “Lettore” in Botanica e Agricoltura presso
l’Istituto di Veterinaria ed infine “Lettore Senior” al Dipartimento di Chimica e Mineralogia. Il
21 marzo 1903 Tswett presenta il lavoro che di fatto costituisce la data di nascita della
“cromatografia”: l’occasione è un Convegno presso la Sezione di Biologia della Società
Naturalistica dell’Università di Varsavia ed il titolo della sua relazione è “Sulla nuova categoria
di fenomeni di adsorbimento e sulle loro applicazioni nell’analisi chimica”. Nel 1915 ritorna a Mosca,
per trasferirsi poi, due anni dopo, all’Università di Tartu (Estonia) in qualità di Full Professor e
nel 1918 all’Università di Voronezh (Estonia), città nella quale muore il 26 giugno 1919.
Giorgio Bonaga
L’IDEA DI TSWETT
Il primo “cromatografo” di Tswett (1903)
eluente
(etere di petrolio)
d = 2-3 cm
L = 30-40 cm
materiale
adsorbente
(CaCO3)
xantofilla 
clorofilla 
clorofilla 
xantofilla  ‘
xantofilla 
P = 0,5 Atm
Il primo “cromatogramma”
Giorgio Bonaga
Il “cromatografo” di Tswett per colonne multiple, con sistema di pressione
Giorgio Bonaga
In uno dei suoi ultimi lavori M. S. Tswett
ha scritto (profeticamente):
L’8 mar
“…tuttavia, è auspicabile un grande sviluppo,
nell’ambito dell’analisi cromatografica, di
colonne capillari “
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA
allumina granulare
(fase stazionaria)
segnale del detector
eluente
(fase mobile)
V
R
cromatogramma
setto di vetro poroso
DETECTOR
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFO A BLOCCHI
introduzione
rivelazione
serbatoio
colonna del
-fase
- degli
fase
campione
stazionaria
mobile
analiti - –
gas o liquido
iniettori
(injector)
solido o liquido
rivelatori
(detector)
Giorgio Bonaga
Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e l’analisi qualiquantitativa dei componenti di matrici complesse. Nell’indagine biologica
sono particolarmente preziose le loro numerose applicazioni nel campo
alimentare.
In tutti i metodi cromatografici, seppure con alcune differenze, i
componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi:
 una FASE STAZIONARIA (un solido o un liquido su un
supporto solido inerte)
 una FASE MOBILE (un gas o un liquido) che fluisce in
modo continuo sulla fase stazionaria.
La separazione è dovuta principalmente a due effetti:
1 . distribuzione dei soluti fra la fase stazionaria e la fase mobile;
2. effetto di trascinamento dei soluti da parte della fase mobile.
Giorgio Bonaga
CLASSIFICAZIONE DEI
PROCESSI CROMATOGRAFICI
Giorgio Bonaga
Denominazione
del metodo
Cromatografia liquida
(fase mobile: liquido)
(LC)
Gascromatografia
(fase mobile: gas)
(GC)
Cromatografia con fluidi
supercritici
(fase mobile: fluido
supercritico)
Metodo
specifico
Fase
stazionaria
Tipo di
equilibrio
liquido/liquido
(LLC = LC)
liquido adsorbito su solido
partizione tra due liquidi
immiscibili
liquido/fase legata
(BPLC)
specie organiche legate alla
superficie solida
partizione tra liquido e
fase legata
liquido/solido
(LSC e TLC)
solido
adsorbimento
scambio ionico
(IEC/SIC)
resina scambiatrice
di ioni
scambio di ioni
esclusione
(SEC/GPC/GFC)
liquido negli interstizi di
un polimero solido
partizione/setacciamento
gas/liquido
(GLC = GC)
liquido adsorbito su solido
partizione tra gas e
liquido
gas/fase legata
(BPGC)
specie organiche legate alla
superficie solida
partizione tra gas e fase
legata
gas/solido
(GSC)
solido
adsorbimento
specie organiche legate alla
superficie solida
partizione tra fluido
supercritico e fase legata
fluido supercritico/
fase legata
(SFC)
CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE
(LC o GC)
fase mobile
(liquido o gas)
fase stazionaria
(liquido)
supporto
(solido)
Le molecole di soluti diversi si ripartiscono in modo diverso tra la fase
stazionaria liquida (supportata da un solido) e la fase mobile liquida o
gassosa.
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO
(LSC o GSC)
fase mobile
(liquido o gas)
siti attivi
fase stazionaria
(solido)
I siti attivi della fase stazionaria solida “legano” le molecole dei solventi e dei
soluti con legami reversibili non polari e polari di “forza” diversa:
1) forze deboli (tipo Van der Waals) e dipolo istantaneo-dipolo istantaneo per
solventi e soluti non polari;
2) dipoli permanenti per solventi e soluti polari;
3) legami H per molecole con H su eteroatomi (N, O, F);
4) interazioni dielettriche per solventi polarizzabili.
Giorgio Bonaga
PRINCIPI TEORICI DELLA
CROMATOGRAFIA
La fase stazionaria è costituita da particelle solide o da un film liquido che
riveste un supporto solido, contenute all’interno di un tubo lungo e sottile
(cromatografia su colonna) o depositate su una superficie (cromatografia
planare). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si
distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la fase mobile (m):
Xm
tempo
Xs
Le due caratteristiche del processo cromatografico sono:
1. Migrazione differenziale
2. Allargamento della banda
Giorgio Bonaga
MIGRAZIONE DIFFERENZIALE
Costituisce la base del processo di separazione cromatografica ed è
strettamente legata alla differenza dei tempi di ritenzione di soluti diversi
(selettività). In sintesi, è diversa la velocità di migrazione di soluti diversi
lungo la fase stazionaria della colonna.
Simuliamo gli equilibri tra i 3 soluti A B C, la fase mobile e una singola
particella di fase stazionaria:
[Cm]
[Bm]
[Am]
[Cs]>[Bs]>[As]
[Bs]
[As]
[Am]>[Bm]>[Cm]
[Cs]
Giorgio Bonaga
Nell’esempio illustrato, all’equilibrio (in realtà i processi cromatografici
sono processi di “non equilibrio”, ma per ora è utile considerarli equilibri
nella descrizione qualitativa dei fenomeni che intervengono), l’analità A è
prevalentemente nella fase mobile, B si ripartisce in modo uguale nelle due
fasi e C è prevalentemente nella fase stazionaria.
La velocità con cui un analita si muove lungo la colonna dipende dalla
frazione di molecole che si trova nella fase mobile ad ogni istante (quelle
che interagiscono con la fase stazionaria non si muovono lungo la colonna,
se non al sopraggiungere di un nuovo volume di fase mobile).
La migrazione differenziale dipende dall’equilibrio di distribuzione di ogni
analita tra la fase stazionaria e la fase mobile e perciò essa è controllata dalle
3 variabili sperimentali che influenzano la distribuzione (ossia le variabili
che influenzano l’equilibrio di distribuzione termodinamico del soluto tra le
due fasi):
• COMPOSIZIONE DELLA FASE MOBILE
• COMPOSIZIONE DELLA FASE STAZIONARIA
• TEMPERATURA
Per modificare la migrazione differenziale allo scopo di migliorare la
separazione tra soluti, si deve operare su queste 3 variabili.
Giorgio Bonaga
COEFFICIENTE DI PARTIZIONE
(O DI DISTRIBUZIONE)
Esprime la COSTANTE TERMODINAMICA Kd, ovvero il rapporto tra la
concentrazione molare dell’analita X nella fase stazionaria e la concentrazione
molare dell’analita X nella fase mobile.
Cs
Kd(X) =
Cm
Nell’esempio precedente i coefficienti di partizione degli analiti A, B e C
sono:
Kd(A) = 1/3 = 0,33
Kd(B) = 2/2 = 1,00
Kd(C) = 3/1 = 3,00
(più veloce di B e C)
(3 volte più lento di A)
(9 volte più lento di A)
Giorgio Bonaga
Anche le molecole dello stesso soluto si muovono lungo la colonna con
velocità differenti: la loro dispersione genera un profilo (banda di eluizione)
di tipo gaussiano, il cui apice rappresenta la velocità media del soluto.
Il termine comune della banda di eluzione è picco cromatografico.
t
velocità media
Giorgio Bonaga
TEMPO DI RITENZIONE
detector signal
tR
t0
W
0
0
t
• Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario ad un soluto per eluire da una
estremità all’altra della colonna (ed essere “visto” dal detector).
• Tempo morto (t0 o tM): tempo di ritenzione di un soluto che non è
trattenuto dalla fase stazionaria e pertanto fluisce alla stessa velocità della
fase mobile.
Giorgio Bonaga
• Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario per eluire il
soluto da un’estremità all’altra della colonna.
• Volume morto (V0 o VM): volume di ritenzione di un soluto che non è
trattenuto dalla fase stazionaria. Esso coincide con il volume di fase mobile
che occupa la colonna.
(es.: colonna di r = 0,5 cm e di lunghezza 100 cm, V0 = 0,5 cm x 0,5 cm x 3,14 x 100 cm = 25
cm3
= 25 ml).
VR e tR sono tra loro proporzionali se il flusso della fase mobile è costante,
in base alla relazione:
V R = tR x F
F = flusso della fase mobile (volume nell’unità di tempo, espresso in ml/min)
(es.: soluto con tR = 5 min, a F = 30 ml/min, il VR = 5 min x 25 ml/min = 125 ml)
Giorgio Bonaga
RELAZIONE TRA FLUSSO (F) E VELOCITA’ MEDIA LINEARE (v)
La relazione tra F (in ml/min) e v (in cm/sec) della fase mobile è:
F
v =
(A x 60)
A = area effettiva della sezione media della colonna (area disponibile per il flusso
della fase mobile)
A = Ag . e
Ag = area geometrica della sezione della colonna
e = (interparticle porosity) rapporto tra la sezione disponibile per la fase mobile e la
sezione totale della colonna
ESEMPIO
Dati F = 1,0 ml/min e una colonna di sezioni:
e = 2,5 mm/5,0 mm = 0,5
Ag = 2,5 mm2 . 3,14  20 mm2 = 0,2 cm2
A = 0,2 cm2 . 0,5 = 0, 1 cm2
da cui:
1,0 cm3 . min-1
v =
 10,0 cm/sec
0,1 cm2 . 60
2,5 mm
5,0 mm
Giorgio Bonaga
La velocità lineare media v (in cm/sec) di flusso della fase mobile è anche espressa
dalla relazione:
v =
L
t0
Nell’esempio precedente, se la lunghezza della colonna L = 100 cm, misurando sul
cromatogramma il valore di t0 = 10” si ottiene:
da cui, anche:
v =
100 cm
 10,0 cm/sec
10”
F = 10,0 cm . sec-1 . (0,1 cm2 . 60)  1,0 ml/min
È intuitivo che la velocità media lineare (in cm/sec) del soluto è espresso dalla
relazione:
v(soluto) =
L
tR
Nell’esempio precedente, con L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di
tR = 100” si ottiene:
v (soluto) =
100 cm
 1,0 cm/sec
100”
Giorgio Bonaga
FATTORE DI CAPACITA’ (k’)
Retention Factor
Il parametro più significativo per descrivere la velocità di migrazione del
soluto lungo la colonna è il fattore di capacità (k’), che esprime il tempo di
ritenzione (tR) di un soluto in funzione del tempo morto (t0):
tR – t0
k’ =
t0
tR
A
t0
0
1’
k’A = 6 – 1 = 5
1
6’
t
Giorgio Bonaga
Dunque k’ rappresenta un tempo di ritenzione relativo (al segnale del
solvente) e consente di confrontare il comportamento di due colonne
differenti rispetto le quali un soluto non rivela gli stessi tR e t0.
Il fattore k’ può essere espresso anche utilizzando il volume di ritenzione e
il volume morto:
VR – V0
k’ =
V0
(es.: dati VR = 250 ml e V0 = 50 ml, il k’ = 250 – 50/50 = 200/50 = 4)
Il fattore k’ è anche espresso dal rapporto tra la concentrazione molare del
soluto nel volume di fase stazionaria e la concentrazione molare del soluto
nel volume di fase mobile (ammesso che si possa parlare di concentrazione
in mol/l del soluto in un materiale solido):
CS . VS
k’ =
CM . V0
(es.: dati CS = 20 mol/l, CM = 10 mol/l, VS = 100 ml, V0 = 50 ml, il k’ = 20/10 x 100/50 = 4)
Giorgio Bonaga
Ricordando che:
Kd =
CS
CM
(es.: dati CS = 20 mol/l e CM = 10 mol/l, Kd = 2,0)
si ottiene:
k’ = Kd .
VS
V0
(es.: dati VS = 100 e V0 = 50, k’ = 2,0 x 100/50 = 4)
Eguagliando le due espressioni di k’:
VR – V0
V0
da cui:
= Kd .
VS
V0
VR = V0 + Kd . VS
(es.: dati V0 = 50 ml, Kd = 2, VS = 100, VR = 50 + 2,0 x 100 = 250 ml)
Giorgio Bonaga
Se il soluto ha un valore della Kd molto basso (tendente a 0) risulterà VR =
V0 , cioè quel soluto è indifferente al processo di ripartizione (analogamente
alla fase mobile). Ogni soluto ha un valore caratteristico di k’ in una
determinata colonna, dal momento che k’ e Kd sono legate dalla relazione:
ponendo:
VS
=F
V0
k’ = Kd .
V0
VS
V0
si ottiene:
k’ = Kd . F
VS
VS
=F
V0
con V0 = VS , K’ = Kd
con V0 = 0,5VS , K’ = 2 . Kd
F è detto rapporto di fase ed è diverso da colonna a colonna; pertanto ogni
soluto ha un k’ caratteristico in funzione della colonna utilizzata.
Il k’ ottimale è compreso tra 3-4
Giorgio Bonaga
ALLARGAMENTO DELLA BANDA
Oltre alla migrazione differenziale dei soluti, il processo cromatografico
comporta una allargamento della banda del soluto (cioè di molecole uguali
che hanno lo stesso coefficiente termodinamico di partizione Kd) rispetto la
sua larghezza iniziale. L’entità dell’allargamento è funzione del tempo che il
soluto trascorre nella colonna, ovvero quanto maggiore è il suo tempo di
ritenzione tanto maggiore è l’allargamento della banda.
t0
t1
t2
Giorgio Bonaga
L’allargamento della banda, che corrisponde al picco nel cromatogramma, è
dovuto alla diversa velocità di migrazione delle molecole del soluto, per
effetto di fattori fisici e cinetici la cui entità dipende dal valore del fattore di
capacità k’ del soluto.
tR
h
t0
W
2
h
2
W
iniezione
I fattori fisici e cinetici che determinano l’allargamento della banda sono:
1.
2.
3.
4.
5.
TORTUOSITA’ DEI PERCORSI
DIFFUSIONE LONGITUDINALE
TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE
TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE
TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA
Giorgio Bonaga
1. TORTUOSITA’ DEI PERCORSI
Le molecole di soluto non seguono lo stesso percorso e pertanto impiegano
tempi diversi per percorrere la stessa lunghezza di colonna, ovvero nello
stesso tempo percorrono lunghezze diverse della colonna.
B
A
v
t0
l
dp
t2
t1
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE
È la diffusione delle molecole del soluto, con direzione parallela all’asse
longitudinale della colonna, nei versi che vanno dalle zone a maggiore
concentrazione di fase mobile alle zone a minore concentrazione.
fase
mobile
fase mobile
(meno concentrata)
g
v
fase mobile
(più concentrata)
Dm
fase mobile
(meno concentrata)
Giorgio Bonaga
3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE
W
Dm
v
dp
Giorgio Bonaga
4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN
FASE MOBILE STAGNANTE
Dm
W
v
dp
Giorgio Bonaga
5. TRASFERIMENTO DI MASSA
IN FASE STAZIONARIA
v
DS
dliq
Q
U
Giorgio Bonaga
OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO
CROMATOGRAFICO
Sono stati discussi la MIGRAZIONE DIFFERENZIALE e, soltanto dal
punto di vista qualitativo, l’ALLARGAMENTO DELLA BANDA.
Per la loro trattazione quantitativa, i parametri che influenzano il processo
cromatografico possono essere riuniti in macrocategorie, ciascuna delle
quali contribuisce, seppure in modo differente, all’aspettopiù importante
della performance di una separazione cromatografica, la RISOLUZIONE.
1. FATTORE DI EFFICIENZA
2. FATTORE DI SELETTIVITA’
3. FATTORE DI CAPACITA’
RISOLUZIONE
Giorgio Bonaga
FATTORE DI EFFICIENZA
L’efficienza di una colonna è definita dalla forma e dall’allargamento dei picchi
cromatografici. Per comprendere nei dettagli il fattore di efficienza occorre introdurre
due concetti fondamentali:
A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO
• definizione
• fenomeni fisici e cinetici che contribuiscono al valore
dell’HETP
• equazione di Van Deemter
B) NUMERO DI PIATTI TEORICI DI UNA COLONNA
• definizione
• equazioni
Giorgio Bonaga
A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO
(Height Equivalent to the Theoretical Plate = HETP)
Consideriamo l’avanzamento di un soluto nella colonna cromatografica. Se
non vi fosse flusso di fase mobile nel I° tratto di colonna si instaurerebbe un
equilibrio di partizione (nel nostro caso Kd = 2/8 = 0,25). In realtà la fase
mobile fluisce e pertanto il processo di partizione procede lungo la colonna
senza il raggiungimento di uno stato di equilibrio permanente. Nel II° tratto di
colonna una parte del soluto trasportato dalla fase mobile migra nella fase
stazionaria (con una Kd = 1,6/6,4 = 0,25). Anche nel III° tratto una parte del
soluto migra nella fase stazionaria (con una Kd = 1,28/5,12 = 0,25). E così di
seguito.
HETP
I°
2,0 M
10,0
8,0 M
II°
1,6 M
6,4 M
III°
1,28 M
5,12 M
Giorgio Bonaga
Non bisogna dimenticare che la quantità di soluti presenti nella fase mobile e
nella fase stazionaria sono espresse dalla concentrazione molare (numero di
moli di soluto in un litro di soluzione). È ovvio che la concentrazione molare
nella fase stazionaria del I° piatto teorico (M = 2,0) si modifica quando
sopraggiunge un volume di fase mobile priva di soluti (M = 0). Dunque
avviene una migrazione inversa, che va dalla fase stazionaria alla fase
mobile, fino a quando il rapporto tra le concentrazioni molari nelle due fasi
non eguaglia il Kd = 0,25 (0,4/1,6). In modo analogo avverrà nel II°, III°, ecc.,
piatto teorico.
HETP
I°
2,0 M
II°
1,6 M
III°
1,28 M
0,4 M
0,32 M
0,256 M
0M
1,6 M
0M
1,28 M
0M
1,024 M
Giorgio Bonaga
Il tratto di colonna nel quale si realizza una condizione “corrispondente” ad
uno stato di equilibrio (cioè un equilibrio reversibile di partizione) è detto
“altezza equivalente di un piatto teorico” (HETP), come se la fase mobile
fosse ferma. L’espressione altezza del piatto teorico è mutuata dalla teoria
delle colonne di frazionamento per distillazione, data l’analogia tra il
processo di distillazione frazionata e il processo di ripartizione
cromatografica, entrambi utilizzati per separare i componenti di una
miscela.
A
(vapore)
percorso
liquido
in ascesa
miscela
(A+B)
altezza del
piatto teorico
piatto sfioratore
B
(liquido)
Giorgio Bonaga
FENOMENI FISICI E CINETICI CHE
CONTRIBUISCONO AL VALORE DELL’HETP
1. DIFFUSIONE EDDY (tortuosità dei percorsi)
È riassunta nell’espressione:
He = 2 dp
.
l
l = costante legata alla regolarità dell’impaccamento della colonna
dp = diametro delle particelle di fase stazionaria
La diffusione eddy:
• dipende dalla regolarità dell’impaccamento (“column packing”)
• è direttamente proporzionale al diametro delle particelle di fase stazionaria
• è indipendente dalla velocità lineare media di flusso della fase mobile
Giorgio Bonaga
2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE
È riassunta nell’espressione:
Hd = 2 g
Dm
v
g = coefficiente dipendente dalla distribuzione delle particelle di fase
stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6 per impaccate; 1,0 per capillari)
Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile =
kT
6phr
v = velocità lineare media di flusso della fase mobile
La diffusione longitudinale:
• dipende dalla distribuzione delle particelle della fase stazionaria;
• è direttamente proporzionale al Dm del soluto nella fase mobile;
• è inversamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della fase mobile
(maggiore velocità minore tempo disponibile alla diffusione longitudinale).
NOTA: la Hd è di scarsa importanza nella LC perché i coefficienti di diffusione nei
liquidi sono bassi, ma è molto importante nella GC per i valori elevati dei coefficienti
di diffusione nei gas.
Giorgio Bonaga
RELAZIONE TRA v E DIFFUSIONE LONGITUDINALE
v bassa
v alta
Giorgio Bonaga
3. e 4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE E IN
FASE MOBILE STAGNANTE
È riassunto nell’espressione:
v
Hm = W dp2
Dm
W = fattore dipendente dal diametro della colonna (= dc2 )
dp = diametro delle particelle di fase stazionaria
Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile
v = velocità lineare media di flusso della fase mobile
Il trasferimento di massa in fase mobile (e in fase mobile stagnanate):
• dipende dal diametro della colonna;
• è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle;
• è direttamente proporzionale alla velocità del flusso della fase mobile;
• è inversamente proporzionale al Dm del soluto nella fase mobile;
Giorgio Bonaga
5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA
È riassunta nell’espressione:
2
Hs = Q U dliq
v
Ds
Q = fattore dipendente dal tipo e dalla forma delle particelle della fase
stazionaria
U = costante relativa alla velocità di migrazione del soluto dalla fase
stazionaria verso la fase mobile (interazione soluto/fase stazionaria)
dliq = spessore del rivestimento liquido depositato sul supporto solido
Ds = coefficiente di diffusione del soluto nella fase stazionaria
v = velocità lineare media di flusso della fase mobile
Il trasferimento di massa in fase stazionaria:
• dipende dal diametro e dalla forma delle particelle di fase stazionaria;
• dipende dalla velocità di migrazione (desorbimento) del soluto dalla fase
stazionaria verso la fase mobile;
• è direttamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della fase mobile;
• è inversamente proporzionale al Dm del soluto nella fase stazionaria.
Giorgio Bonaga
RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI l, g, W, Q, dp, dliq
dp
g
l
Q
dliq
W e g
Giorgio Bonaga
RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI Dm, Ds, U
Dm o Ds =
kT
6phr
k = costante di Boltzmann
T = temperatura
h = viscosità del soluto
3
r = raggio della particella = √ Vp
Dm
Ds
k = R/N = 1,38 . 10-23 J/K
R = costante universale dei gas
N = numero di Avogadro
K = temperatura assoluta
U=
velocità di trasferimento del soluto dalla
fase stazionaria alla fase mobile (dipende
dall’antagonismo tra le interazioni soluto/
fase stazionaria e le interazioni soluto/fase
mobile), ovvero dalla velocità di desorbimento
del soluto dalla fase stazionaria
U
Giorgio Bonaga
Dai contributi all’HETP dei vari fenomeni fisici e cinetici si ottiene il valore
dell’HETP totale:
HETP = He+ Hd+ Hm+ Hs = 2 dp. l + 2 g
Ponendo:
Dm W d 2 v
2 v
+
+ Q Udliq
p
v
Dm
Ds
2 dp l = A
2 g Dm
2
W dp
Dm
costanti caratteristiche per ogni singola
colonna e per una data fase mobile
= B
2
+
Q U dliq
Ds
= C
L’equazione diviene:
HETP = A + B + C . v
v
equazione di Van Deemter
Giorgio Bonaga
HETP (cm)
Diagrammando l’equazione di Van Deemter si ottiene un’iperbole che
correla il valore dell’HETP alla velocità lineare media v di flusso della fase
mobile, ma nel diagramma sono identificabili anche le 3 costanti (A, B e C)
caratteristiche di una certa colonna e di una data fase mobile.
altezza
minima
iperbole equilatera
retta con coefficiente angolare C
B
v
C.v
retta parallela all’asse x
A
velocità ideale
(v = √ B/C )
v (cm/sec)
Giorgio Bonaga
CORRELAZIONE TRA v E HETP
HETP (mm)
Liquid Chromatography
HETP (mm)
v (cm/s)
Gas Chromatography
v (cm/s)
Giorgio Bonaga
CORRELAZIONE TRA v E SEPARAZIONE
4,0 ml/min
1,0 ml/min
1
1
2,0 ml/min
1
2
1
2
2
3
5,0 ml/min
2
3
3
3
0
4
8
0
2
4
0
minuti
1
2
0
0,5
1 1,5
Giorgio Bonaga
HETP NELLA HPLC TRADIZIONALE, FAST HPLC, UPLC
10 mm (1970)
30
HPLC
HETP (mm)
25
5 mm (1980)
HPLC
20
3 mm (2000)
15
FAST HPLC
10
1,7 mm (2004)
5
UPLC
0
0
1
2
3
4
v (mm/sec)
5
6
Giorgio Bonaga
EFFETTI DELL’HETP SULL’EFFICIENZA E SUL TEMPO
•
•
•
•
•
•
flusso: 1,0 ml/min
colonna: 4,6 mm i.d. x 150 mm
fase stazionaria: C18 (5,0 mm)
fase mobile: H2O/CH3CN (50/50)
lunghezza d’onda: 254 nm
campione (20 ml):
1. uracile
2. alcol benzilico
3. benzene
4. toluene
5. alcol etilico
HPLC
mV
1
300
2
200
3
100
4
5
rrr0
- 25
0
2
4
6
8
10
18
t (min)
•
•
•
•
•
•
flusso: 0,6 ml/min
colonna: 2,1 mm i.d. x 50 mm
fase stazionaria: C18 (1,8 mm)
fase mobile: H2O/CH3CN (50/50)
lunghezza d’onda: 254 nm
campione (1 ml):
1. uracile
2. alcol benzilico
3. benzene
4. toluene
5. alcol etilico
mV
2
300
3
200
100
4
5
rrr0
- 25
0
Giorgio Bonaga
UPLC
1
2
4
6
8
10
12
t (min)
B) NUMERO DI PIATTI TEORICI (N)
Il numero di piatti teorici N (ha soltanto un significato matematico, perché
il processo cromatografico non è una singola separazione, ma una sequenza
continua di stati di equilibrio reversibili) è definito dall’espressione:
N=
da cui:
L
HETP
HETP =
L
N
L = 10 cm
HETP = 1 cm
N = 10
Tenendo conto che l’effetto dell’eluizione di un soluto è una curva
gaussiana, si può correlare l’ampiezza della curva con la varianza s2 o con la
deviazione standard s di una misura. In sintesi si può esprimere il piatto
teorico in termini di varianza o di deviazione standard per unità di misura di
lunghezza della colonna:
HETP = 1 cm
HETP =
Giorgio Bonaga
s2
L
HETP . L = s2
L = 10 cm
s2 = 10 cm2
da cui:
2
s = 10 cm  3,15 cm
La relazione tra la deviazione standard s (espressa in centimetri) e la
deviazione standard t (espressa in secondi) è data dalla velocità lineare media
v del soluto (v = L/tR , espressa in cm/sec).
t =
s
v
=
s (cm) tR (sec)
L (cm)
Nel caso precedente, con v = L/tR = 1 (cm/sec), si ottiene che la deviazione
standard t = 3,15 secondi, corrispondente alla deviazione standard, che per
la colonna considerata è s = 3.15 centimetri
Si prenda il tracciato cromatografico con in ascissa il tempo t: la varianza
del soluto si ottiene mediante una procedura grafica sul picco del
cromatogramma.
Si traccino le tangenti al punto di flesso della gaussiana in entrambi i lati
del picco e si congiungano: si ottiene un triangolo che ha come base la linea
di base e come area il 96% dell’area totale sottesa al picco. Questo 96% è
compreso tra due deviazioni standard (± 1s) rispetto l’apice del picco.
Le intercette sono a ± t dal massimo e pertanto l’ampiezza della base del
triangolo isoscele risulta essere Wb = 4t, ovvero t = Wb/4.
Giorgio Bonaga
tR
L
punti di flesso
Wi = 2s
-1 s +1 s
Wh = 2, 35 s
96%
-2s
+2s
Wb=4s=4t
t
t t
t
t
Sostituiamo il valore di t nella t = s tR/L e risolviamo per s:
Wb
4
=
s tR
L
ovvero
s = L Wb
4 tR
Giorgio Bonaga
Nell’equazione:
HETP =
s2
L
sostituiamo il valore trovato di s:
HETP =
Nell’equazione:
L2 Wb2
L 42 tR2
=
L Wb2
16 tR2
L
N=
HETP
sostituiamo il valore di HETP:
N =
L
L Wb
2
16 tR2
=
L 16 tR2
L Wb
2
=
16
tR
Wb
2
=
5,54
tR
2
Wh
La relazione tra Wb e Wh (full width at half maximum) è: Wh = 2,35 s = 2,35 .
Wb/4
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
tR = 17’
Wh = 1’
h
2
Wb = 1’42”
N = 16
N = 5,54
17’
1’42”
17’
1’
2
= 1600
2
= 1600
Il numero di piatti teorici (N), ovvero l’altezza equivalente di un piatto teorico
(HETP) consente di confrontare l’efficienza di due colonne cromatografiche di
differente lunghezza (L).
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
In 2 colonne, rispettivamente di L = 75 mm e L = 100 mm, si introduca la
stessa quantità di una soluzione contenente il soluto A e si registrino i
rispettivi tracciati cromatografici. La colonna più corta risulta più efficiente.
tR = 5’
A
N = 16
5
1
2
= 400
HETP = 75 mm/400 = 0,19 mm
W = 1’
tR = 9”
A
N = 16
9
2
2
= 300
HETP = 100 mm/300 = 0,33 mm
W = 2”
Giorgio Bonaga
ALLARGAMENTI DEL PICCO NON DOVUTI
ALLA COLONNA
In un cromatografo, oltre alla colonna, sono presenti i tubi di connessione e
le giunzioni della linea di flusso della fase mobile che generano dei
fenomeni di turbolenza, ai quali si sommano i fenomeni di diffusione
longitudinale. L’effetto finale è un allargamento del picco cromatografico
che risulta proporzionale al volume dei circuiti entro i quali passa la fase
mobile e quindi anche alla lunghezza dei tubi di connessione. Dunque
all’allargamento della banda concorrono numerosi fattori che, sebbene
poco influenti rispetto quello dovuto alla colonna, possono essere così
riassunti:
WT = Wj + Wf + We + Wd + Wc
dove:
WT = larghezza totale del picco
Wj = allargamento dovuto ai volumi morti e alla dispersione del soluto nell’injector
Wf = allargamento dovuto alle connessioni dopo l’injector e prima del detector
We = allargamento dovuto ai capillari di connessione injector/colonna e colonna/detector
Wd = allargamento dovuto al detector
Wc = allargamento dovuto alla colonna
Giorgio Bonaga
FATTORE DI SELETTIVITA’
È la misura quantitativa dell’entità di separazione tra due soluti e dunque
rappresenta la capacità di un “sistema cromatografico” di distinguere tra due
sostanze. Una colonna cromatografica è tanto più selettiva tra due soluti
quanto maggiore è la loro MIGRAZIONE DIFFERENZIALE (sulla quale è
utile ricordare che influiscono 3 variabili: composizione della fase mobile,
composizione della fase stazionaria, temperatura). In sintesi la selettività è la
capacità di una colonna di differenziare i tempi di ritenzione di due soluti
diversi.
Il fattore di selettività  è definito dall’espressione:
dove:
(tR)B – t0
k’B
=
=
k’A
(tR)A – t0
k’A = fattore di capacità del soluto A
k’B = fattore di capacità del soluto B (con tempo di ritenzione maggiore)
Per modificare il fattore di selettività si può agire in 5 modi (modificazione
della fase mobile, variazione del pH della fase mobile, modificazione della fase
stazionaria, variazione della temperatura, ricorso a effetti chimici specifici di un
determinato soluto).
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
Data il cromatogramma dei due soluti A e B, di cui sono noti i tempi di
ritenzione tRA e tRB e il tempo di ritenzione del solvente t0, si può calcolare
il fattore di selettività . La variazione di  modifica il tR di uno dei due
soluti.
tRB = 6’
tRA = 5’
 =
t0= 1’
6-1
5-1
= 1,25
tRB = 7’
tRA = 5’
 =
t0= 1’
7-1
5-1
= 1,50
Giorgio Bonaga
FATTORE DI CAPACITA’
Il fattore di capacità k’ è funzione della composizione della fase mobile. Il
soluto interagisce con la fase stazionaria, ma la sua migrazione si ottiene con
una fase mobile verso la quale le caratteristiche fisiche e chimiche del soluto
risultino intermedie tra quelle della fase mobile e quelle della fase
stazionaria. In queste condizioni il soluto si ripartisce tra le due fasi e la
variazione del suo k’ è in relazione al tempo che il soluto trascorre nella fase
stazionaria. I valori di K’ sono compresi tra 0 e 10 (ottimali: 3-4).
tR = 4’
t0 = 1’
tR = 6’
t0 = 1’
k’A = 4 – 1 = 3
A
1
k’A = 6 – 1 = 5
A
1
Giorgio Bonaga
RISOLUZIONE (R)
È l’abilità di una colonna cromatografica di separare soluti diversi, ovvero
di produrre cromatogrammi in cui i soluti compaiono come picchi con
profili molto stretti e ben separati tra loro. Il fattore di risoluzione (o
risoluzione), in generale, si riferisce ai due soluti più difficilmente
separabili. Dati i picchi A e B di un cromatogramma, la risoluzione R è
espressa da:
2 Dt
2 (tRB –tRA)
Dt
R =
=
=
(WA + WB)
2W
W
ESEMPIO
Nel primo caso WA = WB, nel secondo WA  WB
tRA = 24’
tRB = 36’
tRA = 24’ tRB = 33’
R = 2 . 33 - 24 = 1,5
4+8
R = 36 - 24 = 1,5
8
WA = 8’ WB = 8’
WA = 4’ WB = 8’
Giorgio Bonaga
La risoluzione dipende da 3 fattori:
1. fattore di efficienza (N): minimo allargamento della banda (He, Hd, Hm e
Hs) espresso dall’equazione di van Deemter (N e HETP);
2. fattore di selettività (): cambiamento dei tempi di ritenzione dei soluti
con miglioramento della loro separazione (composizione fase mobile,
composizione fase stazionaria, temperatura);
3. fattore di capacità (k’): variazione delle caratteristiche della fase mobile
per determinare una variazione dei fattori di capacità k’ dei soluti.
La espressione completa della RISOLUZIONE è:
R= 1 N .
4
-1

.
fattore di
efficienza
fattore di
selettività
k’B
k’B + 1
fattore di
capacità
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
(tR)B = 7’
(tR)A= 6’
A
B
t0= 1’
Giorgio Bonaga
WB = 1’
Dal cromatogramma in cui compaiono i picchi A e B, possiamo calcolare N,  e k’B:
N = 16 . (7/1)2 = 784
 = 7 - 1/6 - 1 = 1,2
k’(B) = 7 - 1/1 = 6,0
e da questi tre fattori calcolare la risoluzione R:
R = 1
4
784 . 1,2 -1 . 6
= 28 . 0,2 . 6 = 7,0 . 0,17 . 0, 86 = 1,02
1,2
6+1
4 1,2 7
RISOLUZIONE E PERCENTUALE DI OVERLAPPING DI DUE
PICCHI DI AREA 1:1
R = 0,4
100%
..
R = 0,8
60%
. .
R = 0,5
92%
R = 0,6
88%
R = 0,7
84%
. .
. .
. .
R = 1,0
20%
.
.
R = 1,25
5%
.
.
.
R = 1,5
0%
.
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
Con una colonna di 10 cm è stato ottenuto il seguente cromatogramma, nel
quale è visibile la sovrapposizione dei picchi A e B. Dal cromatogramma si
possono facilmente calcolare i valori di N, HETP,  e k’B e da questi il
valore della risoluzione, che risulta essere R  1,0. Ammettendo che per
separare al 100% i due picchi occorra una R = 1,5 che colonna bisogna
utilizzare ?
tRB = 5’
tRA= 4’
A
B
t0= 1’
N = 400 [16 . (5/1)2]
HETP = 0,25 mm [100mm/400]
 = 1,33 [(5-1)/(4-1)]
k’B = 4 [5-1]
WB = 1’
Giorgio Bonaga
Preliminarmente si può verificare che:
.
R= 1 N
4
.
-1

k’B
 1,0
k’B + 1
ma dall’espressione della R si può isolare il termine N:
N= 4R
.
.

-1
N = 16 R2 .

k’B + 1
k’B
2
.
k’B + 1
-1
2
k’B
scegliendo una R = 1,5 per una separazione dei picchi = 100%, si ottiene:
N = 16 . 1,5 2 . 1,33/0,33
dalla relazione:
si ottiene:
da cui:
2
.
4+1/4
2 
900
HETP = L/N
L = N . HETP
L = 900 . 0,25 mm = 225 mm = 22,5 cm
Giorgio Bonaga
OTTIMIZZAZIONE DELLA RISOLUZIONE
Come modificare i valori di N,  e k’, in modo da ottenere il fattore di
risoluzione idoneo alla separazione della miscela analizzata ?
Per semplicità consideriamo una miscela di due soli componenti A e B i cui
picchi cromatografici appaiono sovrapposti (è mostrata l’area di
sovrapposizione).
tRB
tRA
A
B
Giorgio Bonaga
A) VARIAZIONE DEL FATTORE DI EFFICIENZA N
Se si aumenta N si ottiene un restringimento dei picchi (lasciando però
inalterato il valore di tRA e tRB) con un miglioramento della risoluzione.
L’aumento di N si ottiene:
• diminuendo le costanti A (l e dp della diffusione eddy) e C (W e dp del
trasferimento di massa in fase mobile; Q del trasferimento di massa in fase
stazionaria) dell’equazione di Van Deemter. La diminuzione delle costanti A e C si
ottiene utilizzando delle particelle di fase stazionaria di piccolo diametro o
particelle porose solo in superficie, e con un impaccamento uniforme della colonna
(diminuisce l’altezza dell’HETP);
• utilizzare una colonna più lunga (aumentando N aumenta il numero di piatti
teorici);
• diminuendo v in modo da ridurre l’altezza dell’HETP e, a parità di lunghezza
della colonna, aumentare il numero di piatti teorici.
Giorgio Bonaga
EFFETTO DELLE DIMENSIONI E DELLA FORMA DELLE PARTICELLE
DI FASE STAZIONARIA SULL’ALLARGAMENTO DEI PICCHI
particelle grandi
di forma sferica
picco simmetrico
medio-alto e medio-stretto
particelle grandi
di forma irregolare
particelle piccole
di forma irregolare
picco simmetrico
basso e largo
picco simmetrico
alto e stretto
Giorgio Bonaga
DIMENSIONI E POROSITA’ DELLA PARTICELLA
DI FASE STAZIONARIA
20 mm
5 mm
400 Å = 0,04 mm
100 Å = 0,01 mm
Ø particella
Ø poro
= 500:1
Ø particella
Ø poro
= 500:1
A parità di rapporto tra diametro della particella e diametro del poro, la particelle di
dimensione più ridotta (specialmente se di forma irregolare) riducono i fenomeni di
trasferimento di massa in fase mobile e in fase mobile stagnante (W e dp) e in fase
stazionaria (Q)
Giorgio Bonaga
PICCHI ASIMMETRICI
Finora, al di là della loro forma e dell’altezza, sono stati considerati soltanto
picchi simmetrici (gaussiani). Non di rado, però, il cromatogramma mostra
picchi asimmetrici dovuti alla criticità della quantità di soluto rispetto la
quantità di fase stazionaria (ovvero al sovraccarico della fase stazionaria),
rapporto generico noto come carico di campione.
La saturazione di tutti i siti attivi della fase stazionaria produce due
conseguenze possibili:
• buona parte del soluto si lega più stabilmente alla fase stazionaria,
producendo una eluizione “ritardata” di soluto sulla coda del picco
(“tailing”);
• la maggior parte del soluto, per effetto cooperativo, si lega e si slega più
rapidamente alla fase stazionaria, producendo una euizione
“anticipata” di soluto sul fronte del picco (“fronting”).
Il tailing è comune, il fronting molto meno. Per evitare l’asimmetria dei
picchi, che peggiora ovviamente la risoluzione di una colonna, si può
operare in due modi: 1) ridurre la quantità di campione introdotta (piccoli
volumi di soluzioni dilute); 2) aumentare la superficie di siti attivi della fase
stazionaria (riduzione della sua granulometria).
Giorgio Bonaga
DISTRIBUZIONE DEI SOLUTI RISPETTO LA VELOCITA’ MEDIA
symmetric
tailing
fronting
Giorgio Bonaga
L’asimmetria (As) dei picchi è dovuta alla deviazione della costante
termodinamica di ripartizione Kd (= CS/Cm) dei soluti e può essere cosi
rappresentata:
As
=


>
<
=
1
h
 
10% h
symmetric
tailing
fronting
As = 1,0
As > 1,0
As < 1,0
Giorgio Bonaga
B) VARIAZIONE DEL FATTORE DI SELETTIVITA’ 
Se si aumenta  si aumenta la differenza tra il tRB e il tRA, ovvero si
modifica la ripartizione dei soluti tra la fase stazionaria e la fase mobile.
L’aumento di  si ottiene:
1.
2.
3.
4.
5.
modificando la fase mobile;
modificando il pH della fase mobile;
modificando la fase stazionaria;
modificando la temperatura;
facendo ricorso ad interazioni chimiche caratteristiche di un solo soluto.
1. MODIFICAZIONE DELLA FASE MOBILE
È la modificazione selettiva del tR di un soluto che produce un aumento del
fattore .
ESEMPIO I
Le LC a fase diretta (silice non funzionalizzata) di una miscela di acetonaftalene e
dinitronaftalene effettuate con le due miscele eluenti riportate in tabella, mostrano
valori di k’ e  tali che soltanto con pentano/piridina (95/5) si separano i picchi, per
effetto della diminuzione della k’ dell’acetonaftalene (probabilmente per
l’interazione tra l’N della piridina e il =CO dell’acetonaftalene) che determina un
Giorgio Bonaga
aumento di .
O
C
CH3 1
2
NO2
NO2
1
N
..
O
C
2
CH3
MISCELA
ELUENTE
C5H12/CH2Cl2
77/23
COMPOSTO
k’
1 acetonaftalene
5,5
2 dinitronaftalene
5,8

1,05
C5H12/piridina
95/5
k’
2,3
5,4

2,04
Giorgio Bonaga
ESEMPIO II
Le LC a fase inversa (silice C:18) di una miscela di cinque composti benzenici,
effettuata con tre diverse miscele eluenti, mostrano valori di k’ e  tali che soltanto
con H2O/THF (63/37) si separano i picchi delle coppie critiche anilina/fenolo e
anisolo/benzene.
MISCELA
ELUENTE
H2O/CH3OH
50/50
COMPOSTO
k’
1
anilina
1,3
2
fenolo
1,6
3
anisolo
4,5
4
benzene
4,7
5
clorobenzene
9,2

1,23
1,04
H2O/AcCN
60/40
k’
1,5
1,4
4,3
4,7
7,7

1,07
1,09
H2O/THF
63/37
K’
1,7
2,3
3,9
4,7

1,35
1,20
6,5
Giorgio Bonaga
NH2
OH
1 2
3 4
2 1
1
Cl
OCH3
5
3 4
2
3
4
5
5
Giorgio Bonaga
2. MODIFICAZIONE DEL pH DELLA FASE MOBILE
I tR di soluti contenenti gruppi acidi o basici dissociabili sono influenzati
dal pH della fase mobile; pertanto modificando il pH si può aumentare il
fattore .
ESEMPIO
I seguenti nucleotidi:
NH 2
O
N
-O
O
P
O
N
O
H
N
N
-O
O
C H2
O
P
O
HO
N
H 2N
-
O
N
N
O
C H2
HO
OH
adenina monofosfato (A)
N
OH
guanina monofosfato (G)
NH2
O
N
-O
O
P O
O-
N
CH2
HO
N
O
O
OH
citidina monofosfato (C)
-O
O
P
O-
N
O
CH2
HO
H
O
O
OH
uracile monofosfato (U)
contengono dei gruppi acidi la cui dissociazione dipende dal pH del mezzo e
pertanto i loro tR dipendono dal pH della miscela eluente.
Giorgio Bonaga
A
tR
G
4
C
3
U
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
pH
A+U
C
G
pH = 3,5
C A
pH = 3,0
U
G
La cromatografia di scambio anionico (IEC) condotta con fase mobile tamponata a pH
3,0 anziché a pH 3,5 consente la separazione della coppia critica A/U.
Giorgio Bonaga
3. MODIFICAZIONE DELLA FASE STAZIONARIA
Il fattore  può essere innalzato scegliendo una fase stazionaria che
produca interazioni selettive soltanto con uno dei soluti della coppia critica.
ESEMPIO
La separazione per LC a fase diretta della coppia acido benzoico/benzoato di
metile, con fase stazionaria non polare risulta critica. Se, tenendo costante la miscela
eluente, si utilizza una colonna con fase stazionaria polare si ottiene la separazione
della coppia critica, per effetto dell’interazione tra i siti polari della fase stazionaria
e il gruppo carbossilico dell’acido benzoico.
1 2
O
C
O
OCH3
2
C
OH
1
Giorgio Bonaga
4. MODIFICAZIONE DELLA TEMPERATURA
Non è molto influente nella LC, ma rilevantissima nella GC. In generale un
aumento di temperatura produce un incremento della forza eluente della fase
mobile, quindi una diminuzione dei fattori di capacita k’ di tutti i soluti e in
ultima analisi un aumento del fattore .
ESEMPIO
Molti composti acidi hanno il valore della costante di dissociazione acida Ka
dipendente dalla temperatura; pertanto la variazione di temperatura produce un
effetto selettivo.
Nella cromatografia a coppie ioniche (fase stazionaria: silice porosa, fase mobile:
acqua/metanolo + perclorato di triottilammonio) di una miscela di sei sostanze il
cromatogramma a 25°C mostra soltanto 4 picchi, mentre quello a 43°C mostra sei picchi
debitamente separati.
OH
COOH
OH
OH
HO3S
SO3H
CH3
SO3H
SO3H
1
OH
2
3
CH3
CH3
4
OH
CH3
H3C
CH3
5
6
Giorgio Bonaga
1+2
3
5+6
4
25°C
1
2
1 = acido salicilico
2 = acido 2-naftol-3,6-disolfonico
3 = acido 1-naftol-5-solfonico
4 = 4.metilfenolo
5 = acido 2,3,4-trimetil-benzensolfonico
6 = 2,5-dimetil-fenolo
3
4
5
6
43°C
Giorgio Bonaga
5. EFFETTI CHIMICI SPECIFICI DI UN DETERMINATO SOLUTO
Si sfruttano le interazioni chimiche di un solo soluto per modificarne il tR e di
conseguenza aumentare il fattore .
ESEMPIO
La LC a fase inversa (silice C18) che utilizza una fase mobile arricchita di Ag+ consente
la separazione della vitamina D2 dalla D3 (in seguito alla complessazione p) e rivela
anche la presenza di un’impurezza, mentre nella cromatografia senza Ag+ è visibile un
solo picco cromatografico irrisolto.
D 2 + D3
Ag+
D2
D3
impurezza
HO
D2
HO
D3
(ergocalciferolo)
(colecalciferolo)
0
5
10
15
Giorgio Bonaga
C. VARIAZIONE DEL FATTORE DI CAPACITA’ k’
Nella LC il valore del fattore k’ è funzione della composizione della fase mobile. La
fase stazionaria interagisce con il soluto e la migrazione del soluto - cioè la
sua ripartizione tra le due fasi - si realizza impiegando una fase mobile tale
che il soluto mostri proprietà chimiche e fisiche intermedie tra quelle della
fase mobile e quelle della fase stazionaria (competitività tra le fasi). Se ci
riferiamo alla polarità delle molecole di soluto, ci sono due possibilità:
FASE STAZIONARIA: polare (allumina o silice attiva)
FASE MOBILE:
apolare (esano, tetracloruro di carbonio)
FASE STAZIONARIA: apolare (polistirene, silice C18)
FASE MOBILE:
polare (acqua, metanolo, tetraidrofurano e loro miscele)
Se facciamo riferimento al secondo caso (RPC), per migliorare la separazione
il parametro che incide sulla risoluzione è la composizione della fase mobile.
È evidente che minore è la polarità del soluto maggiore è il suo tR, ovvero se
il tR del soluto è troppo elevato lo si può diminuire riducendo la polarità della
fase mobile. Il fattore di capacità k’, che si ottiene dal valore del tR , è
correlato alla risoluzione mediante il rapporto k’/k’+1.
Giorgio Bonaga
Analizziamo la curva che correla i valori di k’ con i valori del rapporto
k’/k’+1
k’
k ’+1
1,0
0,5
0
0
1
2
3
4
5
k’
si osserva che il rapporto aumenta rapidamente per poi tendere ad un
asintoto = 1. I valori di k’ ottimali sono compresi tra 3 e 4 (a cui
corrispondono dei valori k’/k’+1 di 0,75 e 0,80) perché per valori superiori
corrispondono incrementi poco significativi del rapporto. Se il valore del tR
del soluto è molto basso l’incremento di k’ ha un senso, altrimenti conviene
agire sugli altri fattori della risoluzione (N o ).
Giorgio Bonaga
A
B
A
B
Giorgio Bonaga
cromatogramma
iniziale
variazione di N
• soluti con gli stessi tR
• minore allargamento dei picchi
variazione di 
• varia il tR di un soluto
• stesso allargamento dei picchi
variazione di k’
• variano i tR dei due soluti
• maggior allargamento dei picchi
A
B
A
B
ACRONIMI DELLA CROMATOGRAFIA
a) TECNICHE CROMATOGRAFICHE
AF
BPC
CC
CGC
CLC
2DGC
FGC
GC
GFC
GPC
GSC
HPCE
HPLC
HPTLC
HRGC
IEC
IPC
LC
LEC
LLC
LSC
= Affinity Chromatography
= Bonded Phase Chromatography
= Column Chromatography
= Chiral Gas Chromatography
= Chiral Liquid Chromatography
= Two Dimensional Gas Chromatography
= Fast Gas Chromatography
= Gas Chromatography (= Gas Liquid Chromatography)
= Gel Filtration Chromatography
= Gel Permeation Liquid Chromatography
= Gas Solid Chromatography
= High Performance Capillary Electrophoresis
= High Performance Liquid Chromatography
= High Performance Thin Layer Chromatography
= High Resolution Gas Chromatography
= Ion Exchange Chromatography
= Ion Pair Chromatography
= Liquid Chromatography
= Ligand Exchange Chromatography
= Liquid Liquid Chromatography
= Liquid Solid Chromatography
Giorgio Bonaga
MGC
NPC
PC
PLOT
RPC
SCOT
SEC
SIC
SFC
TLC
UFGC
UPLC
WCOT
= Multidimentional Gas Chromatography (Comprehensive GC)
= Normal Phase Chromatography
= Paper Chromatography
= Porous Layer Open Tubular
= Reverse Phase Chromatography
= Support Coated Open Tubular
= Size Exclusion Chromatography
= Suppressed Ion Chromatography
= Supercritical Fluid Chromatography
= Thin Layer Chromatography
= Ultra Fast Gas Chromatography
= Ultra Performance Liquid Chromatography
= Wall Coated Open Tubular
B) RIVELATORI PER CROMATOGRAFIA
DAD
ECD
ED
FD
FID
MS
NPD
RID
TCD
UV-VIS
= Diode Array Detector (LC)
= Electron Capture Detector (GC)
= Electrochemical Detector (GC)
= Fluorescence Detector (LC)
= Flame Ionization Detector (GC e LC)
= Mass Spectrometry Detector (GC e LC)
= Nitrogen Phosphorus Detector (GC)
= Refractive Index Detector (LC)
= Thermo Conductivity Detector (GC)
= UltraViolet-Visible Detector (LC)
Giorgio Bonaga