LA CROMATOGRAFIA
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La cromatografia é una
tecnica di separazione di vari
componenti di una miscela
che consiste nello sfruttare
in modo particolarmente
efficiente la diversa
attitudine che ogni molecola
o ione possiede nel
distribuirsi tra due differenti
fasi (una stazionaria e una
mobile)
I componenti della miscela
sono separati in funzione
delle diverse velocità con cui
sono trasportati attraverso la
fase stazionaria dalle fase
mobile
LA CROMATOGRAFIA
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La fase stazionaria può essere costituita da:
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La fase mobile é costituita da un fluido (che si muove
sopra la fase stazionaria), cioè da:
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un solido
un liquido opportunamente supportato.
un liquido
un gas.
I metodi cromatografici si distinguono in:
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Cromatografia su colonna in cui la fase stazionaria è
contenuta in una colonna tubolare e la fase mobile passa
attraverso di essa
Cromatografia planare in cui la fase stazionaria e
depositata su di una superficie piana e la fase mobile migra
su di essa per capillarità
I COEFFICIENTI DI DISTRIBUZIONE
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Consideriamo un sistema formato da due fasi in cui viene
introdotta una sostanza: la sostanza si distribuirà fra le due fasi
a seconda delle sue particolari proprietà chimico-fisiche
Indicando con Cm e Cs le sue concentrazioni nella fase mobile e
nella fase stazionaria rispettivamente, si istaureranno
istantaneamente equilibri di ripartizione del tipo:
con K la corrispondente costante di equilibrio ( o costante di
distribuzione):
K = Cs / Cm
E’ dal valore di K che dipende il tempo di ritenzione, cioè il
tempo che occorre per percorrere l’intera fase stazionaria:
un’elevata concentrazione nella fase stazionaria, rispetto a
quella nella fase mobile, indica una maggiore affinità per la
prima. Altre sostanze, relativamente più affini alla fase mobile e
meno verso la fase stazionaria, verranno più facilmente dislocate
dalle posizioni che occupano e trasportate cosi verso la fine della
colonna, separandosi sempre di più dalle sostanze maggiormente
trattenute.
I COEFFICIENTI DI DISTRIBUZIONE
SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA
I MECCANISMI DI SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA
I MECCANISMI DI SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA
LA CROMATOGRAFIA PLANARE : TLC
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La TLC (Thin Layer Chromatography) è una tecnica cromatografica in cui la
fase stazionaria è costituita da un solido poroso polare come silice (acida) o
allumina (basica) depositata su di uno strato di alluminio o vetro;
La fase eluente è costituita da una miscela di solventi organici apolari che
migrano lungo la lastra cromatografica per capillarità
La miscela da separare è adsorbita o seminata alla base della lastra ed
immersa nella fase mobile in una camera di sviluppo
TLC
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La camera di eluizione è un contenitore ermeticamente chiuso nel
quale si crea un equilibrio tra la fase liquida e quella di vapore, da
cui la fase mobile trae la spinta per la sua migrazione
I componenti del campione vengono separati sulla fase stazionaria
dipendentemente da quanto fortemente essi vi rimangono
assorbiti rispetto a quanto si sciolgono nella fase eluente.
IL FATTORE DI RITARDO RF
Linea di fronte
Linea di semina
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b
Rf B =
a
Il fattore Rf è tipico di
ciascuna sostanza a parità
di fase stazionaria ed
eluente utilizzata e dunque
può essere utilizzato come
parametro per l’analisi
qualitativa di miscele.
SEGUIRE UNA REAZIONE CHIMICA MEDIANTE TLC
LA RIVELAZIONE
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Rivelazione Cromatica
quando le sostanze da separare assorbono nel visibile, la
rivelazione è immediatamente osservabile ad occhio nudo
Rivelazione con luce UV
Se le sostanze da rivelare possiedono cromofori derivanti da
particolari gruppi funzionali quali doppi legami coniugati,
carbonili, carbossili, ecc… è sufficiente illuminare la
lastrina con una lampada UV che emetta a 254 e 366 nm; si
osservano così delle macchie luminose sul fondo scuro. Se
invece le sostanze da rivelare non possiedono cromofori, si
può usare una lastra la cui fase stazionaria, prima o dopo
l’eluizione, viene impregnate di una sostanza fluorescente
ai raggi UV. Illuminando la lastra con le apposite lampade,
si osservano delle macchie scure su sfondo fluorescente
Rivelazione con reagenti chimici
Questi reagenti, vaporizzati sulle sostanze eluite, formano
con esse composti colorati.
LA CROMATOGRAFIA SU COLONNA
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Nella cromatografia su colonna la fase stazionaria è contenuta
in una colonna tubolare. A seconda della natura della fase
stazionaria la cromatografia su colonna può sfruttare metodi
di adsorbimento, ripartizione, scambio ionico o esclusione per
separare i componenti della miscela.
Si distinguono i seguenti metodi:
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Cromatografia su colonna a bassa pressione (LPC).
La fase mobile è un liquido organico a bassa viscosità mentre le fasi
stazionarie, solide, liquide o gel, possono avere caratteristiche chimicofisiche molto variabili. La tecnica prevede la deposizione in testa ad
una colonna (impaccata con un’opportuna fase fissa) di una certa
quantità di miscela da separare. Facendo scorrere l’eluente lungo
questa colonna si ottiene una certa distribuzione dei componenti della
miscela lungo la fase stazionaria
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Cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC)
che consiste nella versione strumentale della cromatografia su
colonna. L'eluente viene fatto fluire ad alta pressione e le sostanze in
uscita vengono rilevate strumentalmente con opportuni dispositivi.
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Gas-Cromatografia (GC), in cui la fase mobile è un gas
IL CROMATOGRAMMA
C
t (min)
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Con il procedere della separazione, le sostanze usciranno dalla colonna dopo il
passaggio di un certo tempo (tempo di ritenzione) durante il quale è fluito un
certo volume di solvente (volume di ritenzione).
Il soluto migra sulla colonna trascinato dall’eluente. Le differenze di velocità
tra le singole molecole dovute a fattori di diffusione fanno sì che tutte le
molecole di un certo soluto escano dalla colonna distribuite in un “range” di
tempo, registrato come una banda.
Il cromatogramma riporta le concentrazioni di sostanza in uscita in funzione
del tempo o del volume di eluente
I PARAMETRI SPERIMENTALI
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tempo di ritenzione
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è il tempo impiegato tra l’iniezione del campione e la registrazione del massimo
del picco;
dipende dalla natura della sostanza, dalla colonna e dalle condizioni operative;
è fondamentale per le analisi qualitative.
area del picco
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è la superficie delimitata dal contorno del picco e la linea di base;
dipende dalla quantità di sostanza in uscita e dalle caratteristiche del rivelatore;
è fondamentale per le analisi quantitative.
I PARAMETRI SPERIMENTALI
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fattore di ritenzione k
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E’ il rapporto tra le moli di soluto che rimangono istantaneamente
legate sulla fase stazionaria e quelle istantaneamente disciolte nella
fase mobile:
k=
CsVs
V
=K s
CM VM
Vm
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È legato alla velocità lineare con cui un soluto attraversa la colonna:
l’attraversamento del soluto è infatti possibile solo attraverso il
flusso della fase mobile in cui esso si scioglie. La velocità con cui un
soluto attraversa la colonna è una frazione della velocità con cui la
fase mobile attraversa la colonna (senza essere trattenuta) e questo
rallentamento è proporzionale al numero di molecole di soluto che vi
si sciolgono, quindi a k
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E’ derivabile sperimentalmente dal cromatogramma come:
k=
tR − tM
tM
dove tM detto tempo morto è il tempo impiegato dal solo eluente ad
attraversare la colonna
I PARAMETRI SPERIMENTALI
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fattore di selettività α
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E’ il rapporto tra la costante di distribuzione del soluto più
fortemente trattenuto (B) e la costante di distribuzione del
soluto meno fortemente trattenuto (A)
α=
K B k B (VM / VS ) k B
=
=
K A k A (VM / VS ) k A
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È legato al fattore di ritenzione k e dà una misura di quanto la
colonna sia in grado di separare i due analiti.
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E’ un numero sempre maggiore dell’unità
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E’ derivabile sperimentalmente dal cromatogramma come:
α=
(t R )B − t M
(t R ) A − t M
CARATTERISTICHE DI UNA SEPARAZIONE
SU COLONNA
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Selettività
E’ definita come la capacita
di una colonna di fornire
picchi distanziati e dipende
dalla temperatura e dalla
natura della fase stazionaria.
A fianco sono riportati due
cromatogrammi, di una
miscela di due composti,
ottenuti con due diverse fasi
stazionarie: nel secondo caso
si ha una maggior selettività.
La misura sperimentale della
selettività è il fattore di
selettività α
CARATTERISTICHE DI UNA SEPARAZIONE
SU COLONNA
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Efficienza
E' la capacita del sistema
cromatografico di mantenere
compatta la banda di eluizione di una
sostanza lungo tutto il percorso della
fase mobile.
Ciò significa ottenere picchi alti e
stretti all’uscita della colonna. La
cosa è di grande importanza, perché
qualora due sostanze avessero tempi
di ritenzione molto vicini se ne
potrebbe ottenere ugualmente la
separazione.
A fianco sono riportati due
cromatogrammi di una miscela di due
sostanze effettuati con colonne
diverse; in ambedue i casi si ha la
stessa selettività, ma nel secondo
caso si ha una maggior efficienza.
PARAMETRI DELL’EFFICIENZA DI UNA COLONNA
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I Piatti teorici
Si definisce Piatto Teorico di una colonna cromatografica quel
tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in
equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che
l’eludente la trascini ad uno stadio successivo.
Se L è la lunghezza della colonna e H l’altezza di ciascun piatto
teorico il numero di piatti teorici N di una colonna è dato da:
L
N=
H
L’efficienza di una colonna è associato ai valori N e H
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Direttamente proporzionale a N
Inversamente proporzionale a H
Il numero di piatti teorici può essere ricavato sperimentalmente dal
cromatogramma come:
Dove tR è il tempo di ritenzione del soluto, e W la larghezza del picco
alla sua base.
PARAMETRI DELL’EFFICIENZA DI UNA COLONNA
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L’altezza dei Piatti Teorici
L’altezza H è una misura indiretta della larghezza della
banda. Se u è la velocità lineare della fase mobile
H=
B
+ CS u + CM u
u
Essa dipende sperimentalmente da un grande numero di
fattori come
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Velocità lineare della fase mobile
Coefficiente di diffusione nella fase mobile
Coefficiente di diffusione nella fase stazionaria
Fattore di ritenzione k
Diametro della particella di impaccamento
N.B. u appare sia al numeratore che al denominatore: il suo
valore deve essere quindi attentamente bilanciato.
PARAMETRI DELL’EFFICIENZA DI UNA COLONNA
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Fattore B/u
detto Fattore di diffusione longitudinale, misura la tendenza
del soluto a disperdersi dal centro della banda verso le zone
limitrofe. Per ridurlo si può: aumentare il flusso per
aumentare la velocità ed al contempo aumentare la viscosità
della fase eluente (se è un liquido) o abbassando la
temperatura (se è un gas)
Fattore Csu
detto fattore di trasferimento di massa nella fase stazionaria,
misura la velocità con cui un soluto è adsorbito e desorbito da
una fase solida; può essere abbassato migliorando
l’impaccamento e diminuendo le dimensioni delle particelle
Fattore Cmu
detto fattore di trasferimento di massa nella fase mobile,
misura la diffusione turbolenta del soluto nella fase mobile.
Può essere diminuito eliminando i percorsi preferenziali del
soluto nella colonna (particelle più piccole e meglio impaccate)
CARATTERISTICHE DI UNA SEPARAZIONE
SU COLONNA
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La risoluzione
Questo fattore tiene conto
sia della selettività che
dell’efficienza, e indica il
grado di effettiva
separazione ottenuto per
due sostanze in un processo
cromatografico.
Dal punto di vista numerico
si ottiene dalla relazione:
Per avere una buona
separazione, dal punto di
vista quantitativo, si deve
avere risoluzione almeno 0,8
IL PROBLEMA GENERALE DELL’ELUIZIONE
Ottenere una risoluzione più alta possibile nel tempo totale
di analisi più corto possibile
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Eluizione isocratica
eluizione in condizioni costanti di fase eluente
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Stessa miscela di solventi per tutta la durata della corsa (in
cromatografia liquida)
Stessa temperatura per tutta la durata della corsa (in gascromatografia)
Eluizione in gradiente
eluizione in cui si varia la composizione della fase mobile
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Programmata di solvente (in cromatografia liquida)
Programmata di temperatura in (gas-cromatografia)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA
La cromatografia su
colonna è un sistema
analogo alla TLC, ma
gravitazionale per cui
le sostanze che
“corrono”di più si
trovano nel basso
della colonna e
vengono eluite per
prime.
La fase stazionaria
impaccata può essere
costituita da solidi
porosi, liquidi
dispersi su solidi,
resine a scambio
ionico, resine a
esclusione.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA
HPLC
(HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
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Cromatografia liquida su colonna che impiega materiali di
impaccamento con un diametro delle particelle compreso tra 3-10µm
(40000-60000 piatti teorici per metro). Le colonne hanno una
lunghezza compresa tra 10-30 cm ed un diametro compreso tra 4-10
mm
Per garantire elevate velocità di flusso (0,1-10 ml/min) la fase mobile
è spinta attraverso la colonna da opportuni sistemi di pompaggio ad
elevate pressioni e resistenti alla corrosione da parte di numerosi
solventi
Tali sistemi di pompaggio sono costruiti in maniera tale che i solventi
di eluizione possano essere automaticamente miscelati nelle giuste
proporzioni prima di entrare in colonna, consentendo di scegliere tra
una eluizione isocratica ed una in programmata di solvente.
Prima che i solventi vengano aspirati dalle pompe vengono
“degassati” tramite il gorgogliamento di un gas inerte che allontana i
gas disciolti, e passati attraverso un filtro che elimini piccole scorie
solide
HPLC
HPLC
HPLC
¢  Sistemi
di iniezione o loop
HPLC
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Colonne di guardia
per aumentare la vita di una colonna analitica, in testa ad essa è
applicata una colonna di guardia che rimuove dai solventi particelle
indisciolte e contaminanti. La composizione di una colonna di
guardia dovrebbe essere simile a quella della colonna analitica
Rivelatori
I rivelatori più ampiamente usati per la cromatografia liquida sono
rivelatori spettrofotometrici UV-Vis. La sorgente usata può essere il
mercurio (lunghezze d’onda discrete) ma si usano anche filamenti in
tungsteno o deuterio equipaggiati con monocromatori. Spesso sono
strumenti detti a diode array che possono mostrare l’intero spettro di
assorbimento di un analita che entra in colonna.
Possono analogamente essere utilizzati spettrofluorimetri o
amperometri come rivelatori di specie fluorescenti o redox/attive.
Infine un altro tipo di rivelatore che ha trovato molte applicazioni si
basa sul cambiamento dell’indice di rifrazione del solvente causato
dalle molecole di analita. In contrasto con la maggior parte dei
rivelatori precedentemente indicati, questo è meno selettivo perché
l’indice di rifrazione è in generale meno specifico per le varie
sostanze e può essere influenzato anche da soluti presenti nella fase
mobile.
GAS-CROMATOGRAFIA
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Nella tecnica gas-cromatografica la fase mobile è un gas che fluisce
attraverso una colonna in cui si trova la fase stazionaria, la quale può
essere un solido granulare poroso oppure un liquido.
Secondo lo stato fisico della fase stazionaria, la gas-cromatografia si
può suddividere in cromatografia gas solido (GSC) e in cromatografia
gas liquido (GLC).
Le colonne si dividono in impaccate (largamente usate in passato) o
capillari, o tubolari aperte, le quali non contengono particelle (la fase
stazionaria è solo presente sulla superficie interna del capillare)
L’unica limitazione della gas-cromatografia é la necessità di rendere
volatili i campioni da analizzare
I meccanismi di separazione relativi alla GC sono sostanzialmente
due: ripartizione e adsorbimento, di cui si è già parlato. Il primo nel
caso che la fase stazionaria sia liquida, il secondo quando è solida.
GAS-CROMATOGRAFIA
GAS-CROMATOGRAFIA
STRUMENTAZIONE
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Sistema di alimentazione gas di trasporto
(carrier).
Si tratta di bombole di gas inerte (azoto, elio,
argon), talvolta può essere utilizzato anche
l’idrogeno. Lo scopo principale e quello di
trascinare i componenti della miscela in
analisi lungo la colonna cromatografica.
Iniettore o camera di iniezione.
Il suo compito e assicurare l’istantanea
vaporizzazione del campione. Poiché con l’uso
di colonne capillari la quantità di campione
da iniettare e dell’ordine dei nanolitri, e
misurare queste quantità con siringhe e
praticamente impossibile sono state messe a
punto particolari tecniche di iniezione (split)
che consentono di far entrare effettivamente
in colonna solo una parte dell’iniettato.
La camera di iniezione è corredata da un
sistema di resistenze variabili attraverso le
quali è possibile fissare la temperatura
ritenuta più adatta per la vaporizzazione
della miscela. L’introduzione del campione
viene effettuata con una iniezione su un
apposito disco di gomma al silicone.
STRUMENTAZIONE
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Colonna.
La colonna può essere di due tipi:
impaccata o capillare.
“canalicoli”
dell’impaccata
La colonna impaccata (diametro interno
2-4 mm, lunghezza 1-4 m), è costituita
da una colonna di acciaio o di vetro(due
metri circa) riempita di materiale inerte
sul quale e distribuita una pellicola
sottile di liquido (fase stazionaria)
continuamente attraversata dal gas di
trasporto.
Le colonne capillari (diametro interno
0,1-0,8 mm, lunghezza 10-100 m), ormai
di uso comune, sono costituite da tubi
capillari di vetro con pareti ricoperte di
un film sottile di fase stazionaria. molto
più lunghe dell’impaccata (anche cento
metri), di diametro molto minore e
quindi contenenti una quantità molto
minore di fase stazionaria, per cui la
quantità di campione da iniettare e
molto più piccola e viene eluita prima.
unico “canalone”
della capillare
STRUMENTAZIONE
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Le colonne sono alloggiate
in una camera
termostatica, in genere a
circolazione di aria calda,
sistema col quale viene
assicurata una buona
stabilita di temperatura.
Un dispositivo permette
all’operatore di fissare la
temperatura, la quale può
essere mantenuta
costante per tutta la
durata dell’analisi
(isoterma) oppure fatta
variare (programmata).
RIVELATORE
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I dispositivi in grado di rivelare la presenza di una
sostanza estranea nel gas di trasporto, a valle della
colonna, possono dividersi in universali e selettivi. I
primi consentono di individuare tutti i componenti di
una miscela, i secondi rivelano solo particolari
categorie di composti. Tra i rivelatori più usati, si
segnalano:
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Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)
Spettrometro di massa rappresenta il rivelatore ideale
per la gascromatografia, perché permette di analizzare in
tempo reale i singoli picchi in uscita dalla colonna,
effettuando sia un’analisi qualitativa che quantitativa,
mediante il confronto dello spettro di massa ottenuto con
uno dei numerosi spettri memorizzati nella banca dati.