DIFFUSIONE
Una banda di soluto si muove attraverso una colonna cromatografica. Idealmente, una
banda infinitamente stretta iniettata all’inizio della colonna, emerge all’uscita con una forma
gaussiana (in condizioni meno ideali la banda diviene asimmetrica).
Una delle principali cause dell’allargamento della banda è la DIFFUSIONE dovuto al flusso
(J) della sostanza da una zona a maggiore concentrazione ad una a minore concentrazione.
dc
 mol 

J


D

dx
m2 s 
D = coefficiente di diffusione
Flusso 
Profilo gaussiano della banda
per effetto della diffusione
c 
2
m
ex
4Dt
( 4Dt )
Segno negativo perché il flusso netto va da
una zona a maggiore ad una a minore
concentrazione
Equazione del picco gaussiano
y 
2
1
e (x   )
 2
2 2
dev. std del
picco
  2Dt
IL MODELLO DEI PIATTI TEORICI
Questo modello suppone che la colonna cromatografica contenga un elevato numero di
“strati” detti piatti teorici sui quali si instaura l’equilibrio di ripartizione dell’analita tra fase
stazionaria e fase mobile.
L’analita si sposta verso la fine della colonna attraverso il movimento della fase mobile,
all’equilibrio su un piatto, al piatto successivo.
È importante sottolineare che i piatti non esistono realmente all’interno della
colonna, sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene in
colonna. Inoltre sono utili per poter valutare l’efficienza della colonna.
EFFICIENZA DELLA COLONNA
Se il soluto nella colonna ha percorso una distanza x alla velocità di flusso lineare ux, il
tempo che ha trascorso nella colonna sarà t = x/ux.
Se per effetto della diffusione la 2 della banda è 2Dt, di conseguenza:
 2  2Dt  2D
 2D 
x
x  H x
 
u x  u x 
Altezza del Piatto Teorico
H  2 x
L’Altezza del Piatto Teorico è la
costante di proporzionalità tra la varianza
della banda (2) e la distanza che essa ha
percorso (x)
Altezza del piatto piccola
Picchi stretti
Migliori separazioni
Per un soluto che emerge da una colonna di lunghezza L, il numero di piatti teorici (N)
dell’intera colonna, è la lunghezza L divisa per l’H :
L L x
L2 16  L2
N 
 2  2 
H


w2
poichè L  x e   w/4.
Esprimendo invece L e w in unità di tempo anzichè di spazio
N 
16  t R2
w
2

5.55  t R2
w 12/ 2
Quindi il numero di piatti teorici per una colonna può essere calcolato esaminando
un picco cromatografico dopo l’eluizione.
Come si può osservare dall’equazione, il numero di piatti della colonna è
diverso per ciascun analita nel campione.
La teoria cinetica
Una descrizione più realistica del processo che avviene all’interno della colonna tiene conto
anche del tempo necessario all’analita per il raggiungimento dell’equilibrio tra fase stazionaria
e fase mobile (nel modello dei piatti teorici si considera che il raggiungimento dell’equilibrio è
istantaneo)
La forma del picco cromatografico è pertanto influenzata dalla velocità di eluizione, ma anche
dai cammini preferenziali dell’analita all’interno della fase stazionaria.
Considerando i vari meccanismi che contribuiscono all’allargamento del picco si arriva alla
Equazione di Van Deemter per l’altezza del piatto teorico:
H=A+B/u+Cu
dove u è la velocità media della fase mobile mentre A, B, e C sono fattori che contribuiscono
all’allargamento del picco e sono costanti per una determinata colonna e fase stazionaria
A – Diffusione di Eddy. La fase mobile contenente l’analita fluisce
attraverso la colonna impaccata con la fase stazionaria, pertanto le
molecole di analita seguiranno cammini casuali e differenti all’interno
della fase stazionaria. Ciò comporta un allargamento della banda
perché i diversi cammini hanno diversa lunghezza e quindi le molecole
usciranno in tempi diversi.
B/u– Diffusione Longitudinale. Poiché la concentrazione
dell’analita è maggiore al centro della banda, l’analita diffonderà dal
centro alla periferia determinando un allargamento della banda stessa.
Questo effetto è tanto meno pronunciato quanto più elevata è la
velocità della fase mobile (l’analita passa meno tempo all’interno della
colonna).
C u – Resistenza al trasferimento di massa. Se la velocità della
fase mobile è elevata e se l’analita ha una forte affinità per la fase
stazionaria, l’analita nella fase mobile esce prima dell’analita nella fase
stazionaria originando un grande allargamento della banda. Questo
effetto è tanto maggiore quanto più è veloce la fase mobile.
In cromatografia la RISOLUZIONE fra 2 picchi è definita come:
Risoluzion e 
wm = larghezza media dei 2 picchi
t r 0.589 t r

wm
w 1 / 2m
w1/2m = larghezza media a metà altezza dei 2 picchi
Risoluzione
= 0.5
Risoluzione
= 0.75
Risoluzione
= 1.00
Risoluzione
= 1.50
Per l’analisi quantitativa è preferibile una risoluzione uguale o superiore a 1.5
È utile mettere in relazione R con il numero di piatti teorici della colonna, i fattori
di selettività e i fattori di ritenzione dei due analiti. L’equazione che correla tutti
questi parametri è la seguente:
N    1  1  k B'
R 


4    k B'



Per ottenere un’alta risoluzione, è necessario massimizzare i 3 termini.
Un aumento del numero di piatti teorici, aumentando la lunghezza della colonna,
porta ad un aumento nel tempo di ritenzione, ma può provocare anche un
aumento della larghezza della banda.
In alternativa per aumentare il numero di piatti si può ridurre l’altezza del piatto
teorico riducendo la dimensione delle particelle della fase stazionaria.
La separazione può essere migliorata controllando il fattore di capacità variando la
composizione della fase stazionaria.
Un tocco di realismo: bande di forma asimmetrica
Il coefficiente di ripartizione K = Cs/Cm dovrebbe essere costante ed indipendente dalla
concentrazione del soluto. Se così fosse avremmo bande simmetriche di forma
gaussiana. Nelle colonne reali tuttavia K cambia all’aumentare della concentrazione del
soluto e le bande si presentano codate.
Segnale
Sovraccarico per iniezione di troppo
soluto: la banda emerge gradualmente
dalla colonna, ma termina bruscamente
IDEALE
Tempo
Segnale
Sovraccarico (fronting)
K = Cs/Cm = costante
Cs
Tempo
K diminuisce
K aumenta
Segnale
Codatura (tailing)
Tempo
Cm
Alcuni
siti
della
fase
stazionaria
trattengono il soluto più fortemente di
altri: si origina così una codatura
prolungata