Cromatografia
Scrittura del colore
Il termine cromatografia indica un insieme di
tecniche che hanno lo scopo di separare una
miscela nei suoi componenti, per permetterne il
riconoscimento qualitativo e quantitativo
Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo
l’analisi di miscele complesse come sono la
maggior parte dei campioni di natura organica
Cenni storici
 1903-1906: nascita “Cromatografia” grazie a
un botanico russo (M. Tswett)
 1938: introduzione della T.L.C.
cromatografia a scambio ionico
e
della
 1941: cromatografia di ripartizione liquidoliquido
 1944: cromatografia su carta
 1950: cromatografia a fase inversa
 1951: gas-cromatografia
 1959: cromatografia a permeazione di gel
 1965:
cromatografia
prestazioni
liquida
ad
alte
Principi della cromatografia
-la differente velocità di migrazione dei componenti
costituenti una miscela (equilibrio dinamico)
-Fase mobile (MP), liquida o gassosa
-Fase stazionaria (SP), solida o liquida, stratificata su
vetro o alluminio o impaccata in una colonna
Fase fissa
A
Fase mobile
Fase fissa
B
Fase mobile
Fase fissa
C
Fase mobile
-Spostamento
della
fase
mobile
determina
l’avanzamento del soluto in essa contenuto mentre le
molecole che sono distribuite nella fase stazionaria
resteranno momentaneamente ferme
XM  Xs
Soluto X migrerà con una velocità proporzionale a Kx
o coefficiente di distribuzione tra le due fasi
(dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi)
Il coefficiente di distribuzione del componente X è
[X]s
definito come:
KX 
KA ≠ KB ≠ KC
[X]m
A: il campione viene iniettato
all’entrata della colonna
B  D: la fase mobile fa
spostare il campione attraverso
la fase stazionaria
Flusso del solvente
Quale componente
ha K maggiore?
A
B
C
D
VA =
1
V M + V S KA
[A]S = 0 A non ha alcuna
affinità per la fase
fissa e si muove
con il fronte della
fase mobile
[A]M = 0 A non ha alcuna
affinità per la
fase mobile per
cui si distribuisce
completamente
nella fase fissa
senza spostarsi
Riportando il segnale in funzione del tempo si ottiene il
cromatogramma
Se [X]f=0 allora Vx è max e uguale alla Veluente e il
Volume dell’eluente necessario a eluire X è pari al
volume dello spazio interstiziale non occupato dalla
fase fissa detto volume interstiziale o Vm.
Se [X]f≠0 allora Vx è < di Veluente e il Volume
dell’eluente necessario a eluire X volume di
ritenzione VR sarà maggiore del Vm.
Allora VR-Vm = VR’ o volume netto di ritenzione
Tempo di
ritenzione
Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della
miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere
rivelato come picco dal detector.
tM = t0 = tempo morto
tR’ = tR - t0 = tempo netto di ritenzione, tempo trascorso
da un dato soluto nella fase stazionaria
Relazioni che quantificano l’interazione di un dato
soluto con la fase stazionaria
VR = tR . F
Vm = t0 . F
F (velocità di flusso)
FATTORE di CAPACITA’
V = velocità lineare media di migrazione di un soluto = L/tR
U = velocità lineare media di flusso della fase mobile = L/t0
V = u . (frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile)
V = u . [CM.VM/CMVM+CSVS]
V=u.
L/tR = L/t0 .
1
1 + K VS/VM
1
1 + CSVS/CMVM
tR = t0 (1 + K VS/VM) = t0 (1 + K’)
t R  tM
K'
tM
Fattore di ritenzione
o rapporto di
distribuzione di massa
k’ dipende:
•dalla T°
•dalla natura delle fasi
•dalle caratteristiche dell’impaccamento
•dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria
k’ non dipende:
•dalla lunghezza della colonna
•dal flusso
Usato per confrontare le prestazioni di colonne diverse
a parità di eluente
La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie:
riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere
fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa
delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B>
(tR)A.
k'B ( tR )B  tM


k' A ( tR )A  tM
Fattore di
separazione o
Ritenzione relativa
Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza di una
colonna (ampiezza dei picchi):
1) Altezza equivalente di piatto teorico H
2) Numero di piatti teorici N
L
N
H L = lunghezza colonna
Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un
equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi.
Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di
equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola
separazione, N ha un significato puramente matematico.
Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità
di una separazione (migliore è la capacità di separazione della
colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna.
Si può dimostrare che
t 
N  16 R 
W
2
W
W = larghezza del picco
Separazione ottimale
a)
separazione con
scarsa risoluzione e
basso N
b)
migliora la
risoluzione ma è
sempre basso N
c)
ottima risoluzione e
buono N
Si può dimostrare che:
1
   1  k IB
R
N
 I
4
   kB  1
risoluzione scarsa per scarsa
efficienza e scarsa selettività
buona risoluzione dovuta a buona
efficienza e buona selettività
buona risoluzione dovuta a buona
selettività, ma efficienza non
troppo elevata
risoluzione scarsa dovuta ad una
basso selettività.
Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza
(picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da
una buona differenziazione del comportamento dei soluti
(selettività).
Interazione soluto-fasi
Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e
le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non
fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria
oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo
separativo le seguenti interazioni:
• legami a idrogeno
• interazioni dipolo-dipolo
• interazioni dipolo-dipolo indotto
• forze di Van der Waals
• formazione di composti di
interazione
• attrazione coulombiana
• interazioni steriche
Meccanismi di separazione
•
•
•
•
•
ripartizione
adsorbimento
scambio ionico
esclusione
affinità
In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente
decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere
presenti più tipi di interazione nello stesso processo
cromatografico
Cromatografia
Fase mobile: liquida
Fase mobile: gassosa
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA (L.C.)
Fase fissa: solida
GAS-CROMATOGRAFIA
(G.C.)
Fase fissa: liquida
CROMATOGRAFIA di
ASSORBIMENTO (L.S.C.)
Colonna/strato sottile
CROMATOGRAFIA a
SCAMBIO IONICO (L.S.C.)
Colonna/strato sottile
GEL CROMATOGRAFIA
Colonna/strato sottile
CROMATOGRAFIA di
AFFINITA’
CROMATOGRAFIA di
RIPARTIZIONE (L.L.C.)
Colonna
Strato sottile
Carta
Fase mobile: fluido
supercritico
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SUPERCRITICA (S.F.C.)
RIPARTIZIONE
La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare
inerte (gel di silice) o è ad esso chimicamente legato; in questo
liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e
la fase mobile devono invece essere immiscibili.
Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra
le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi
di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o
liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile.
≡Si-OH + R-SiCl3 + 2 H2O
≡Si-O-Si(OH)2-R + 3 HCl
La cromatografia di ripartizione è
chiamata in fase normale se la fase
stazionaria è più polare della fase
mobile, mentre è chiamata fase
inversa se la fase stazionaria è meno
polare della fase mobile. Si tratta della
tecnica più comunemente impiegata
per la separazione di sostanze
organiche
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI
RIPARTIZIONEdi RIPARTIZIONE (L.L.C.)
In fase normale
Fase stazionaria polare
Fase mobile a bassa polarità
≡Si-O-Si(R)2-CN
Solventi organici
≡Si-O-Si(R)2-NH2
Soluzioni acquose
(zuccheri, steroidi, amminoacidi,
proteine e peptidi)
In fase inversa
Fase stazionaria apolare
Fase mobile molto polare
≡Si-O-Si(CH3)2
Soluzioni acquose o tamponate
≡Si-O-Si-CH2-(CH2)6-CH3
Miscele acqua/metanolo/acetonitrile
≡Si-O-Si-CH2-(CH2)16-CH3
(ammine, vitamine, idrocarburi, analgesici)
ADSORBIMENTO
La fase stazionaria è un solido in polvere (gel di silice o allumina);
sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono
stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela
da separare (ma anche con le molecole d’acqua, disattivandolo). Si
parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gassolido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile.
Per sostanze molto polari è preferibile
usare gel disattivati, mentre per
sostanze con bassa polarità si
preferiscono le silici non modificate.
Le fasi mobili più usate in ordine di
polarità crescente e quindi di potere
eluente sono:
Esano,
isottano,
cloroformio,
acetonitrile, metanolo, acqua.
SCAMBIO IONICO
La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte (resine
sintetiche) contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi
funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono essere
scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il
meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti
di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti
nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)
Resina a scambio cationico: -SO3H, -COOH
Resina a scambio anionico: -NH2, -N(CH3)2
La fase mobile è un tampone anionico (acetato) o cationico (tris)
contenenti ioni della stessa carica di quella dei campioni (capacità di
spostamento, pH, t °)
La cromatografia a scambio
ionico è impiegata per la
separazione di sostanze
ioniche o ionizzabili
(amminoacidi, nucleosidi,
nucleotidi)
Fase stazionaria: scambiatore cationico forte polistirene solfonato
Fase mobile: tampone citrato/acido citrico
Eluizione con gradiente di pH e forza ionica, ad esempio
citrato/acido citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na+ da 0,2 a 0,4M.
Gli aminoacidi vengono eluiti sequenzialmente quando i valori del
pH si avvicinano al loro punto isoelettrico:
a pH basso: acidi (es. Asp, Glu)
a pH neutro: neutri (es. Gly, Val)
a pH basico: basici (es. Lys, Arg)
Un analizzatore di amminoacidi contiene un sistema continuo di
registrazione dell'eluato: nel cromatogramma ad ogni picco
corrisponde un amminoacido.
ESCLUSIONE DIMENSIONALE
La fase stazionaria è un solido poroso o un gel di granulometria
definita (acrilammide o sephadex) per cui i campioni vengono
separati in base alla dimensione delle loro molecole.
Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei
pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un
certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori
ed escono dalla colonna in tempi brevi (la fase stazionaria si
comporta da setaccio, intervallo di PM).
Si parla di cromatografia di esclusione
dimensionale (SEC)
oGel permeazione (GPC) per la
separazione di sostanze insolubili in
acqua
oGel filtrazione (GFC) per la
separazione di sostanze solubili in acqua
La
tecnica
è
impiegata
per
la
separazione di molecole di grandi
dimensioni (peptidi, proteine, polimeri)
AFFINITA’
In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico,
reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da
separare interagiscano con la fase stazionaria a cui è
chimicamente legato un ligando specifico così da ottenere
l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di
cromatografia di affinità (AFC).
Ligandi tipici sono substrati di reazioni enzimatiche, inibitori,
cofattori, recettori, basi di sequenza complementari, ormoni,
anticorpi, ecc…
Le matrici più utilizzate sono l’agarosio, la poliacrilammide, il
destrano, la cellulosa; scarse interazioni aspecifiche, buone
proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili, stabilità a variazioni
di pH e di temperatura.
La cromatografia di affinità è
impiegata nella separazione di
molecole
di
interesse
prevalentemente biochimico
Cromatografia
classica su colonna
Le colonne impiegate sono generalmente in
vetro e possono essere di varie dimensioni
secondo le esigenze.
Il riempimento della colonna può essere
costituito da materiale solido adsorbente,
finemente
suddiviso,
asciutto
e
scelto
opportunamente in base alla separazione da
effettuare (per LSC) oppure la colonna viene
riempita con supporto granulare inerte,
generalmente gel di silice, che viene
impregnato con solvente opportuno e che
costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una
resina a scambio ionico per cromatografia
ionica.
Il solvente scelto, contenente la miscela da
separare, viene fatto fluire attraverso la
colonna.
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta
pressione è frutto dell’evoluzione tecnologica delle tecniche di
cromatografia su colonna.
I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione,
ma le fasi stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con
materiali di granulometria molto fine (3-10 mm) e controllata: in
tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile
e fase stazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo.
Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga
fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con
impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente
diventa molto lento.
Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di
50-150 atm, diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min,
sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi ragionevolmente brevi.
HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica:
velocità, risoluzione e sensibilità superiori
A
B
C
A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d
= 100 mm, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)
B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 mm, D = 1-3 mm, L = 50100 cm)
C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 mm, D = 2-6 mm, L
= 10-50 cm)
d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna
LC classica:
1) dimensione delle particelle e
diametro interno della colonna molto
maggiori che nella HPLC
2) velocità di flusso molto basse
3) tempi di analisi lunghi
HPLC:
1) impaccamento di dimensioni
molto inferiori, compresso in
colonne sottili
2) contropressioni maggiori
3) tempi d’ analisi contenuti
Cercando di aumentare la velocità del
solvente, diminuiscono efficienza e
risoluzione a causa del limitato
trasporto di massa nei pori profondi e
nei lunghi canali interparticellari.
Per favorire il flusso della fase mobile è
quindi necessario l’uso di pompe ad
alta pressione. Efficienza aumentata di
10-100 e tempi di separazione
diminuiti (miglioramento nei termini di
trasporto
di
massa
della
fase
stazionaria e della fase mobile).
La pressione dipende da diversi paramentri:
η = viscosità del solvente
V = velocità lineare di flusso
L = lunghezza della colonna
K = costante legata alle caratteristiche fisiche del
riempimento della colonna
d = diametro della colonna
1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar
1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2
Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con
diametro interno di 1-5 mm.
Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o
da particelle o impurezze presenti nel campione e nel solvente. È per
questo che è necessario proteggere l’ingresso della colonna principale
con una pre-colonna che contiene la stessa fase stazionaria della
colonna principale, ma è più corta e può venire periodicamente
sostituita.
La fase stazionaria più comune è costituita da particelle microporose di
silice ad elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area
superficiale (alcune centinaia di m2/g). Questa fase stazionaria viene
generalmente impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più
comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando
fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie
della silice.
Fasi polari comuni
Fasi non polari comuni
R = (CH2)3NH2
ammino
R = (CH2)17CH3
ottadecile
R = (CH2)3CN
ciano
R = (CH2)7CH3
ottile
La C18 (anche indicata con ODS) è la
fase stazionaria di gran lunga più
utilizzata in HPLC
• pompa con pressione
fino a 400 Atm,
flusso stabile tra 0.1
e 10 ml/min
• riserva di solventi: uno o più
solventi che possono essere
utilizzati singolarmente o in
miscela
• sistema di iniezione costituito da una
valvola a più vie e da un circuito a
volume fisso, o loop, nel quale si
mette il campione
• colonna
cromatografica ed
eventuale
precolonna
• rivelatore per
monitorare gli
eluati
• PC per gestire il
sistema e i dati
Eluizione isocratica e a gradiente
Con 1 solo solvente o con
una miscela di solventi di
composizione costante.
SOLVENTE
DEBOLE
SOLVENTE
FORTE
FORZA
INTERMEDIA
GRADIENTE
DI SOLVENTE
Variazione
continua
della
composizione del solvente per
aumentare la forza eluente. Una
forza
eluente
crescente
è
necessaria per eluire i soluti più
fortemente trattenuti e per
migliorare le separazioni.
Sistemi di rivelazione
•
Sensibilità adeguata al problema
•
Buona stabilità e riproducibilità
•
Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di
grandezza
•
Tempi di risposta rapidi
•
Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più
classi di soluti
Rivelatore
LOD (ng)
Selettività
Utilizzabile in gradiente?
0.1-1
selettivo
SI
Indice di rifrazione
100-1000
generale
NO
Fluorescenza
0.001-0.01
selettivo
SI
Elettrochimico
0.01-1
selettivo
NO
Conduttimetrico
0.5-1
selettivo
NO
Assorbimento IR
1000
selettivo
SI
Spettrometro di massa
0.1-1
generale
SI
Assorbimento UV
GAS-CROMATOGRAFIA
In gascromatografia (Martin e Synge 1941 e poi
James e Martin 1952) la fase mobile è un gas che
fluisce in una colonna in cui è posta la fase
stazionaria.
I meccanismi di separazione dei componenti la
miscela sono determinati dalla fase stazionaria,
poiché quella mobile funziona solamente da gas di
trasporto(carrier).
Condizione indispensabile per operare un’analisi
gascromatografica su una miscela è che essa sia in
grado di passare in fase vapore alla temperatura di
lavoro.
VANTAGGI DELLA GC
•Poco costosa
•Altamente sensibile (10-9 - 10-13
g/mL)
SVANTAGGI DELLA GC
Non
applicabile
all’analisi
di
macromolecole, sostanze termolabili,
altamente polari o idrofile
•Robusta
•Riproducibile
•Rapida
•Separazione di mix complesse
(100 analiti in GC-capillare)
Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria =
solido adsorbente)
Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria =
liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato
sulle pareti della colonna)
A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il
gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i
componenti lungo la colonna.
Trattamento del campione
Derivatizzazione: usata per sostanze altobollenti
• Reagenti sililanti
HMDS esametildisilazano (zuccheri)
TMCS trimetilclorosilano (acidi carbossilici)
BSA
bistrimetilsililacetamide
(alcoli,
ammine,
acidi
carbossilici,
fenoli, steroidi, alcaloidi)
BSTFA bistrimetilsililtrifluoroacetamide (come BSA froma deivati poù
volatili)
• Reagenti acilanti
TFAA anidride trifluorometansolfonica (alcoli, fenoli, ammine)
PFPA anidride pentafluoropropionica (alcoli, fenoli, ammine)
HFBA anidride eptafluorobutirrica (tioli)
• Reagenti alchilanti
TMPAH idrossido di trimetilanilinio (COOH, NH2, OH, barbiturici, sedativi,
basi xantiniche, alcaloidi fenolici)
BF3 in etanolo (acidi grassi dei trigliceridi)
PFBBr pentafluorobenzilbromuro (acidi, fenoli, tioli e solfonammidi)
SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO
He, Ar, N2
SISTEMA DI INIEZIONE
FUNZIONI:
- Introduzione del campione
- Evaporazione del campione
- Ingresso del gas di trasporto
- Collegamento alla colonna
L’entrata
deve
essere
ad
una
temperatura sufficientemente elevata
da
permettere
l’evaporazione
istantanea del campione e abbastanza
grande da permettere al vapore di
espandersi
senza
essere
spinto
indietro.
Nelle colonne impaccate, il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del
gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della
miscela (T° 50-100°C).
Nelle colonne capillari, la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a
100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole.
COLONNE
Per gas-cromatografia
“canalicoli”
dell’impaccata
Le impaccate (acciaio, vetro o
rame) contengono
particelle
solide inerti di appropriata
granulometria,
eventualmente
imbevute della fase stazionaria
liquida (diametro = 0.75 - 4
mm; lunghezza = 6 m) .
Le capillari sono tubi molto più
sottili e lunghi (diametro = 0.1 0.75 mm; lunghezza = 15-300
m) in cui la fase stazionaria è
depositata sulle pareti interne.
Queste ultime hanno un elevato
numero di piatti teorici (anche
300.000) grazie alla loro elevata
lunghezza.
WCOT= wall-coated-open-tubular
SCOT= support-coated-open-tubular
unico “canalone”
della capillare
Le fasi stazionarie più usate in
GC di adsorbimento sono:
Gel di silice
Allumina
Carbone attivo
Carbone grafitizzato
Microparticelle sferiche di carbone
Zeoliti
Sali inorganici
I supporti inerti più usati in GC di
ripartizione sono:
Terra di Diatomee
Teflon
Microsfere di vetro
Le fasi stazionarie più usate
(ancorate, legate) sono:
Idrocarburi
Esteri e poliesteri
Polieteri
Ammidi, ecc….
Influenza della temperatura sulla corsa cromatografica
• Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore
corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti
della miscela.
• Per miscele particolarmente complesse con punti di ebollizione
troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica.
• Per tali miscele un
temperatura
troppo
alta consentirebbe una
buona separazione dei
componenti altobollenti
ma
ammasserebbe
quelli più bassobollenti.
• Al
contrario,
una
temperatura
troppo
bassa, non consentirebbe
di
separare
quelli
altobollenti.
Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo lineare, e prevede
le seguenti tappe:
Isoterma iniziale: indica quanto tempo si rimane a una determinata
temperatura.
Fase di rampa: si stabilisce la temperatura da raggiungere e con
quale velocità.
Isoterma finale: indica il tempo che si deve restare alla
temperatura più alta.
Raffreddamento: si attua dopo la fine della registrazione del
cromatogramma
45°
145°
programma di T
Sistemi di rivelazione
•
Sensibilità adeguata al problema
•
Buona stabilità e riproducibilità
•
Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di
grandezza
•
Tempi di risposta rapidi
•
Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più
classi di soluti
Rivelatore
Selettività
Termoconducibilità TCD
Non selettivo
Insostituibile per l’analisi dei gas
Ionizzazione di fiamma
Poco selettivo
Azoto-fosforo (NPD) o a fiamma alcalina
A Cattura di elettroni (ECD)
Spettrometro di massa
selettivo
Selettivo
Organofosforici, diossine, benzodiazepine
generale
Intervallo
di
linearità
range
di
concentrazioni
compresa tra il limite di
rivelabilità e il limite di
linearità.
Limite di
rivelabilità
è la
concentrazione
minima che dà
una risposta
doppia del
rumore di fondo
Limite di linearità
è la concentrazione massima al
di là della quale il segnale non è
più
proporzionale
alla
concentrazione
(con
una
tolleranza del 5%).
Intervallo di
risposta
dinamico
intervallo di
concentrazioni
entro il quale il
rivelatore
risponde, anche
se non in
maniera lineare
Limite intervallo
di
risposta
dinamico;
oltre
questa
concentrazione non
si
possono
fare
misure
Riassumendo
• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente
stabili, non ionici

Gascromatografia
• analiti non volatili o poco volatili, ionici,
ionizzabili o non ionici, termicamente instabili

Cromatografia liquida
La Radiazione Elettromagnetica è costituita da un campo
magnetico e da un campo elettrico oscillanti su due piani
perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda.
Parametri che descrivono la natura ondulatoria dell’onda:
-Lunghezza d’onda l: distanza tra i due massimi o tra i due
minimi.
-Ampiezza d’onda: in valore assoluto la distanza tra la
direzione di propagazione dell’onda e il punto di max o di
min.
-Frequenza u: numero di onde che passano un dato punto
nell’unità di tempo.
La descrizione quantitativa delle interazioni tra la
radiazione e la materia è possibile solo se si considera la
radiazione come formata da quantità discrete, chiamate
FOTONI. L’energia dei fotoni è proporzionale alla frequenza
della radiazione.
SPETTROSCOPIA
E’ la disciplina che studia l’INTERAZIONE delle radiazioni
elettromagnetiche con gli stadi quantici di energia della
materia.
In virtù di questa interazione, si determina una variazione
dell’energia che può interessare nuclei, elettroni, atomi o
molecole.
assorbire la radiazione > il suo contenuto energetico
(SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO)
emettere la radiazione < il suo contenuto energetico
(SPETTROSCOPIA di EMISSIONE)
diffondere la radiazione (SPETTROSCOPIA RAMAN)
Tutti questi tipi d’interazione possono avvenire solo per
determinate l della radiazione incidente e quindi solo per
determinate u. hu = E’-E” differenza di energia tra i due
stati del sistema.
SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO
Processo mediante il quale una sostanza rimuove selettivamente
alcune frequenze dalla radiazione elettromagnetica.
Lo spettro non è altro che la rappresentazione grafica delle
transizioni energetiche permesse (Regole di selezione) sotto
forma di righe.
1. Transizioni elettroniche
ETOT = Ee + Ev + Er + Et
2. Transizioni vibrazionali
3. Transizioni rotazionali
Een
4. Transizioni traslazionali
Ee1
Ee0
Evn
Ev2
Ev1
Ev0
Ern
Er0
u, E
l
TRANSIZIONI
Rotazionali Vibrazionali Elettroniche
Onde Radio
Variazioni di energia
troppo deboli per
essere osservate se
non sotto un intenso
campo magnetico
STATI di SPIN
INDOTTI
MAGNETICAMENTE
EPR (elettroni)
NMR (nuclei)
Infrarosso lontano,
microonde
Visibile, Ultravioletto,
Raggi X
Infrarosso
La legge dell’assorbimento o Legge di Beer
E’ la legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento
delle radiazioni elettromagnetiche in generale e con particolare
riferimento alle soluzioni.
A=e.b.C
A = assorbanza o frazione di energia assorbita
b
=
cammino
ottico
(cm),
attraversata dal raggio
spessore
della
soluzione
c = concentrazione (mol/L) della specie in esame
e=
assorbività o coefficiente di estinzione molare o
assorbimento molecolare (IUPAC), cioè
l’assorbanza
concentrazione e spessore unitari.
di
a
(l, dal solvente, dalla natura chimica della specie che
assorbe; non dipende in generale dalla temperatura)
Se e è costante e b (cammino costante) allora l’equazione
assume la forma A = kc e quindi del tipo y = mx.
Altro modo per descrivere il fenomeno dell’assorbimento consiste
nell’usare la definizione di Trasmittanza
T = I/I0
T = trasmittanza
I0 = intensità della radiazione incidente
I = intensità della radiazione che esce dal campione
Questa grandezza è legata all’Assorbanza secondo la relazione:
A = log 1/T = log I0/I
Se T% = 100T
A = log 100/T% = 2-log T% oppure T% = 102-A
A varia tra 0 e infinito mentre T% varia tra 0 e 100.
Fattori che possono determinare deviazioni dalla linearità:
-Concentrazione della soluzione (10-2/10-7), se troppo concentrata
si può avere una variazione dell’indice di rifrazione e quindi di e,
così come si possono formare coppie ioniche o complessi o
aggregati.
-Variazioni di pH, perché influenza l’equilibrio tra due forme della
stessa sostanza, aventi e diverso ad una stessa l.
-Temperatura, perché influenza sempre un eventuale equilibrio;
tuttavia variazione nell’ordine di ±5 °C non comportano particolari
problemi.
-Solvente, perché la polarità del solvente influisce sulla
distribuzione elettronica nella molecola analizzata. Ad es solventi
polari o con alta costante dielettrica esercitano un effetto
batocromo.
-Co-presenza di fenomeni di fluorescenza (emissione) e diffusione
della radiazione.
-Fattori strumentali (ampiezza della banda passante)
Spettri di assorbimento e scelta della lunghezza d’onda
per la misura dell’assorbanza
Una sostanza assorbe in modo diverso
le varie radiazioni, cioè a diverse l
corrispondono vari e.
Lo spettro di assorbimento che si
ottiene è uno spettro a bande
caratterizzato dalla presenza di massimi
(picchi di assorbimento) e minimi.
Ogni sostanza ha un suo spettro
caratteristico ed è proprio individuando
la posizione dei massimi caratteristici
che si realizza l’analisi qualitativa.
L’analisi quantitativa viene invece fatta
scegliendo
un’opportuna
l,
detta
lunghezza d’onda analitica, scelta in
modo che corrisponda ad un max o ad
un min.
Transizioni elettroniche e cromofori
L’assorbimento nel campo UVVIS è dovuto a transizioni
elettroniche
da
orbitali
di
legame a orbitali di non-legame
o di anti-legame a più alto
contenuto energetico e questo è
possibile solo se la radiazione
possiede un’energia pari al DE
tra i due livelli.
π
π*
n
π*
Le prime sono caratteristiche
dei sistemi insaturi e le seconde
di eteroatomi con doppietti
liberi; sistemi di questo tipo
sono indicati come cromofori.
C=C, C≡C, C=O, C≡N, C=S, N=O, N=N, polieni, aromatici, ecc…
Effetto dei sostituenti
Effetto Batocromo: diminuisce il DE della transizione, alzando il contenuto
energetico dell’orbitale legante o diminuendo quella dell’orbitale anti-legante o nonlegante. Il picco (l’assorbimento) viene spostato a l maggiori (sostituenti e- ricchi o
donatori).
Effetto Ipsocromo: effetto opposto al precedente; aumenta il DE e quindi
diminuisce la l dell’assorbimento (sostituenti e- poveri o elettronegativi).
Effetto Ipercromico: risulta aumentato e o per aumento della probabilità che
avvenga quella data transizione o per aumento della superficie del cromoforo;
aumenta l’assorbanza ma rimane costante la l a cui il composto assorbe.
Effetto Ipocromico: effetto opposto al precedente; diminuzione di e e quindi
dell’assorbanza.
Rivelatore UV a l fissa
Vantaggi e svantaggi
Il principale vantaggio è il basso costo.
Inoltre l’elevata intensità della radiazione
della lampada a Hg permette di ottenere
elevata sensibilità per composti che
assorbono a 254 nm.
Il principale svantaggio è determinato
dalla scarsa selettività dovuta alla
necessità di lavorare a l fissa.
Vantaggi
Rivelatore UV a l variabile
- Versatilità: possibilità di selezionare l da
190 a 800 nm.
- Elevata sensibilità: potendo scegliere la l
ottimale (max assorbanza) per un
analita.
- Selettività:
quando
si
hanno
sovrapposizioni di picchi si può variare la
l in modo tale da minimizzare
l’assorbimento degli interferenti.
- Possibilità di utilizzare gradiente di
eluizione, scegliendo una l alla quale la
miscela solvente non assorbe.
Dopo un’ora
Separazione di una
tossina proteica, della
tossina coniugata con la
biotina e dell’avidina
(fattore antinutrizionale)
Avidina
Glicoproteina
dell’albume
che
impedisce
l’assorbimento
della biotina
Biotina (IUPAC)
Vitamina H o I
(tedesca)
Vitamina
B7
(anglosassone)
Vitamina
(francese)
B8
Spettrometro di Massa
Lo spettrometro di massa può fornire informazioni qualitative e quantitative
sui componenti della miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere uno
spettro di massa, le molecole portate in fase gassosa, vengono ionizzate.
Gli ioni sono quindi accelerati per mezzo di un campo elettrico e vengono
poi separati in base al loro rapporto massa/carica (m/z).
L’accoppiamento HPLC-MS è una tecnica relativamente “giovane” e sempre
più utilizzata.
Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS può servire come rivelatore
universale (o comunque come un rivelatore che risponde ad un’estesa
gamma di soluti) e sensibile.
L’accoppiamento HPLC/MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60),
ma soltanto dalla metà degli anni ’70 appaiono le prime pubblicazioni
scientifiche.
Le difficoltà di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si
utilizzano solventi molto diversi, in funzione del tipo di analisi, (es.
acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi in LC sono molto
elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Per
accoppiare le 2 tecniche sono pertanto necessarie opportune interfacce
che oltre a ridurre i flussi dovranno consentire anche la
vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.
1) il sistema di entrata
2) la sorgente ionica, il cuore dello spettrometro, in cui le molecole
neutre vengono trasformate in ioni e si frammentano
3) l’analizzatore, in cui gli ioni vengono separati in funzione del rapporto
massa/carica (m/z)
4) il rivelatore, in cui gli ioni vengono raccolti ed i segnali inviati, dopo
amplificazione, al registratore che converte le informazioni contenute
nei segnali in uno spettro.
analita
Campo
magnetico
analizzatore
fascio
ionico
Camera di
ionizazione
Campo elettrico
acceleratore
Spettrometro di Massa a Quadrupolo Iperbolico
1)
M + e-
M+ + 2e-
2) M+
M1+
M3+
M2+
M4+ , etc.
Abbondanza relativa
Ogni
molecola
ha
una
frammentazione
unica
e
caratteristica che, come una vera e propria impronta
digitale, ci permette di identificare e di risalire alla
molecola madre.
Normalizzazione dei picchi
50
100
150
200 massa relativa
1)Formazione ione molecolare (parente)
2)Formazione ioni di frammantazione
3)Formazione di ioni di riarrangiamento (trasposizione)
AB + e-
[AB]+. + 2e-
PM
[AB]+.
[A]+ + [B].
catione
[A]+
[C]+
catione
[AB]+.
radicale
+ [D]
molecola neutra
[EF]+. + [D]
ione radicale
Informazioni sulla struttura
(identificazione dei
composti)
molecola neutra
La presenza di picchi isotopici, aventi quindi rapporto
m/z = M+ + 1 (o 2, 3, 4, ecc…)
con intensità proporzionale all’abbondanza isotopica naturale
Tre requisiti (necessari, ma non sufficienti) perché un
picco sia effettivamente lo ione molecolare:
- Picco a massa più alta
- Ione ad elettrone dispari (ione radicalico)
- Spiegare tutti gli ioni più importanti nella zona delle masse
alte dello spettro in base a perdite logiche di specie neutre.
Grado di insaturazione (n° di anelli + n° di = legami) =
X–½Y+½Z+1
CxHyNzOn
C 6H 6
6 - 3 + 1 = 4 (1 anello + 3 = legami)
C 7H 5O
7 – ½ 5 + 1 = 5,5
CO
Regola dell’azoto
Ione molecolare pari = 0, 2, 4, …. n° di N
Ione molecolare dispari = 1, 3, 5, ….n° di N
(azoto ha massa pari ma valenza dispari)
Analisi dei picchi isotopici
- M+2: stessa intensità di M
- M+2: 33% intensità di M
- M+2: 4% intensità di M
- M+2, M+4, M+6,…..
1 atomo di Br
1 atomo di Cl
1 atomo di S
2, 3,….atomi di Br, Cl,..
Frammentazione
Ioni neutri non vengono rivelati ma possono essere
individuati indirettamente dalla differenza di massa tra
lo ione molecolare e lo ione frammento vicino.
Es.
- Perdite
- Perdite
- Perdita
- Perdite
di 1, 2, 3 sono plausibili
tra 4-14 no
di 15 palusibile (CH3)
tra 21-25 no
Tipi di ionizzazione
Elettronica (E.I.)
Chimica (C.I.)
I. di campo (F.I.)
Disassorbimento di campo (F.D.)
1)E.I.
Gli ioni vengono generati per interazione con e- ad alta
energia emessi da un filamento di tungsteno o renio
portato all’incandescenza per riscaldamento elettrico.
(Alta frammentazione, bassa intensità dello ione molecolare)
2)C.I.
Gli ioni vengono generati per interazione con ioni derivanti
dalla ionizzazione elettronica di un gas reagente (metodo
soft di ionizzazione); metano, isobutano, ammoniaca.
(Oltre alla ionizzazione si ha il trasferimento di un protone per cui
si formerà [MH]+; minore frammentazione)
3)F.I. e F.D.
in entrambi i metodi gli ioni sono generati da un forte
campo elettrico che si instaura a causa della forte
differenza di potenziale tra due elettrodi (metodo soft di
ionizzazione); cambia il sistema di introduzione del
campione che nell’F.D. è deposto direttamente in soluzione
sull’anodo (miglioramento dell’efficienza, picco [M]+ o [MH]+
intensi)
E.S.I. Electro spray ionization
E’ il metodo di ionizzazione che più di frequente si trova
accoppiato all’LC, potendo utilizzare campioni liquidi o
solidi, scarsamente volatili o termolabili (soft ionization).
Molecole con PM relativamente alto
Presenza di legami deboli e labili
Elevata sensibilità
Il
campione
liquido
viene
spruzzato sotto pressione e le
goccioline
caricate
dal
potenziale applicato al capillare.
Nella camera di evaporazione, il
gas e il riscaldamento fanno
evaporare e desolvatare le
goccioline cariche. Aumenta la
densità
di
carica
fino
all’esplosione in goccioline più
piccole caricate positivamente o
negativamente.
Quattro barre cilindriche parallele
due caricate positivamente e due
negativamente collegate a due a
due
ad
un
generatore
di
potenziale elettrostatico e a un
generatore
di
radiofrequenze
(variabile nel tempo).
Gli ioni subiscono l’azione combinata dei due campi. Per un certo valore
del rapporto Potenziale elettrostatico/radiofrequenza solo ioni aventi un
determinato rapporto m/z riescono a passare oltre al quadrupolo e
arrivare al rivelatore. Occorre fare una scansione, cioè far variare il
potenziale elettrostatico e la radiofrequenza ma mentenere costante il
loro rapporto.
Semplicità costruttiva
range di masse più stretto
Minor costo
minore risoluzione
Tollera pressioni maggiori (LC, GC)
Maggiore velocità di scansione
CUMARINA
Warfarin (Cumadin®)
(1,2-BENZOPIRONE)
Attività: anticoagulante
Interferisce con le funzioni
della vitamina K, coinvolta
nell’attivazione
Dei fattori della coagulazione del
sangue
O
O
H3CO
HO
H3CO
O
O
O
O
7-idrossicumarina (Umbelliferone)
6,7-dimetossicumarina (Scoparone)
Attività: chemoprevenzione del cancro
Attività: antiossidante, vasorilassante, antiasmatico
O
O
O
Psoralene (furanocumarina lineare)
Attività: cura di eczemi e psoriasi
O
O
O
Angelicina (furanocumarina angolare)
Attività: antiinfiammatoria
Analisi GC-MS della 5,7-dimetossicumarina standard
OCH3
H3CO
O
O
M+ - CH3 = 191
M+ - CO = 178
M+ - CH3CO = 163
M+ - CH3CO – CH3 = 148
M+ - CH3CO – CO = 135
M+ - CH3CO – CH3CO = 120
Identificazione della 5,7-dimetossicumarina nell’ESTRATTO in METANOLO
OCH3
H3CO
O
O
5,7-dimetossicumarina
Cromatografia
Cromatogramma
tempo di ritenzione
(spettro di massa)
area del picco
Analisi qualitativa Analisi quantitativa
ANALISI QUALITATIVA
-tr sostanza X e tr sostanza
nota (standard)
-Iniettare
una
certa
quantità
(10-20%)
della
sostanza presunta, pura, nel
campione in esame: se il
picco di X risulta aumentato
vi è buona probabilità di
aver individuato l’identità
dell’incognito.
-Stessa cosa viene ripetuta
usando
condizioni
sperimentali
diverse;
se
anche
in
questo
caso
l’arricchimento
fa
aumentare il picco allora
siamo
quasi
certi
dell’identità della sostanza.
-Se ho accoppiato uno spettrometro di massa si può evitare
questa procedura macchinosa.
ANALISI QUANTITATIVA
 L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle
aree dei picchi, dal momento che esiste proporzionalità diretta tra
la misura effettuata e la concentrazione che la determina (almeno
in certi range).
 Sono metodi comparativi cioè basati sulla relazione matematica
tra il parametro misurato (risposta o segnale) e la concentrazione
dell’analita.
 Quindi richiedono
standard.
la
calibrazione
mediante
 Dopo opportuna elaborazione delle aree,
concentrazione percentuale dei componenti.
si
soluzioni
risale
alla
 Il calcolo dell’area del picco viene fatta direttamente dal
computer e viene stampata sul cromatogramma.
 Alla base comunque ci sono delle regole per mezzo delle quali è
possibile risalire alle aree dei picchi.
 Necessità di determinare quantitativamente tutti i componenti di
una miscela o solo alcuni o al limite uno solo (necessità quindi di
avere risolti tutti i picchi, solo alcuni, uno solo).
Ritagliare
il
picco
e
pesarlo, confrontandolo con
il peso di 1 cm2 della stessa
carta.
massa
picco
-Metodo laborioso
-Precisione
Metodi geometrici
-Gaussiana
-Triangolazioni
Importante è la
pulizia del picco
(simmetria e
mancanza di
sovrapposizioni)
area
picco
massa
1 cm2
Si applica il metodo della
gaussiana calcolando l’ampiezza
del picco a metà altezza e
considerando i due picchi come
separati.
In questo caso l’ampiezza a metà
altezza è ricavabile dalle semiampiezze.
L’integrazione
ricostruisce
la
matematica del picco
ne calcola l’area e
all’area totale (area
minore)
elettronica
funzione
maggiore,
la sottrae
del picco
I metodi per la calibrazione possono essere divisi in due gruppi:

Uso di Standard Esterni (analizzati separatamente dal
campione).

Uso di Standard Addizionati ad ogni campione (Standard
Interni o aggiunti).
Standard esterni
Una serie di standard di questo tipo è
costituita da unità che contengono
quantità note e differenti di analita.
 Si inietta un volume noto e preciso
del campione e si registra il
cromatogramma; poi, si prepara una
soluzione a concentrazione nota del
componente da determinare e si
inietta lo stesso volume, registrando il
cromatogramma.
S(A)c/S(A)s = Cc/Cs
Cc = Cs . S(A)c/S(A)s
-E’ importante fare in modo che le concentrazioni comparate
(campione e standard) non differiscano troppo tra loro.
-Occorre una grande accuratezza e riproducibilità nel misurare il
volume da iniettare.
-Iniezioni ripetute, sia del campione che dello standard, e poi fare
una media delle aree
-Le iniezioni vanno effettuate in un intervallo di tempo piuttosto
breve per evitare le deviazioni dovute a variazioni ambientali o
strumentali.
 Costruzione di rette di taratura o calibrazione
Si preparano diverse soluzioni (da 3 a 5) a concentrazioni note e
crescenti dell’analita e si riportano su un grafico A/[] i valori letti
sul cromatogramma; si dovrebbe ottenere una retta passante per
lo zero (se ci sono deviazioni significative allora si aumenta il
numero delle soluzioni standard).
Si inietta la soluzione campione e si registra il valore dell’area. Si
interpola la concentrazione incognita del campione.
Le soluzioni standard devono simulare al meglio la matrice del campione,
e quindi devono contenere tutti i reattivi (e nelle stesse concentrazioni)
contenuti nella soluzione campione. Questo comporta ricontrollare le
rette di taratura ogni volta che le soluzioni dei reattivi vengono preparate
di fresco.
-Conoscenza della matrice
-I vari componenti la matrice non causino interferenza con il campione
Standard aggiunti
Anche in questo caso possiamo distinguere due metodiche:
 Metodo delle aggiunte standard o multiple
Consiste nel preparare soluzioni dell’analita contenenti volumi noti
e crescenti di soluzione standard della stessa specie da analizzare.
Vi sono diversi modi per attuare il metodo delle aggiunte:
a) Introdurre una certa quantità di soluzione incognita in più
matracci (3-4), aggiungere in ogni matraccio volumi diversi di
soluzione standard (a concentrazione da 10 a 100 volte maggiore)
e poi portare a volume con la soluzione incognita. Quindi di
riportano in un grafico A/[] i valori ottenuti dalle diverse soluzioni.
Sol. STANDARD
1 mL
1
2 mL
2
3 mL
3
4 mL
4
A
A4
Cx
sarà
data
dall’intercetta
sull’asse
delle
x
(differenza tra i due
zeri)
cambiata
di
segno
e
sarà
inferiore rispetto alle
concentrazioni degli
standard.
Y = mx
A3
Y = mx + q
A2
A1
A0
0
0
Cx
C1
C1+Cx
C2
C2+Cx
C3
C4
C3+Cx
C4+Cx
C agg
C eff
In realtà il metodo, rapido e pratico, non è del tutto rigoroso, perché il contenuto di
analita varia leggermente all’interno delle diverse soluzioni così come la
concentrazione finale dello standard aggiunto.
Es. nel matraccio 1 abbiamo miscelato 99 mL a concentrazione Cx e 1 mL
a concentrazione ad es 1000 ppm,
mentre matraccio 4 abbiamo
miscelato 96 mL a concentrazione Cx e 4 mL a concentrazione 1000 ppm.
Quindi gli incrementi effettivi differiscono leggermente.
Infatti ammettendo che
Cx = 20 ppm e che 1 ppm = 1 mg/L = 1 mg/mL allora Cx = 20 mg/mL
Quantità dell’analita X nei diversi matracci:
-20 mg/mL . 99 mL = 1980 mg = 1,98 mg
-20 mg/mL . 98 mL = 1960 mg = 1,96 mg
-20 mg/mL . 97 mL = 1940 mg = 1,94 mg
-20 mg/mL . 96 mL = 1920 mg = 1,92 mg
Quantità dello standard aggiunto nei diversi matracci:
1000 mg/mL . 1 mL = 1000 mg = 1,00 mg
1000 mg/mL . 2 mL = 2000 mg = 2,00 mg
1000 mg/mL . 3 mL = 3000 mg = 3,00 mg
1000 mg/mL . 4 mL = 4000 mg = 4,00 mg
Queste quantità si trovano alla fine nei matracci da 100 mL
L’incremento in termini di massa ad es per il matraccio 1 è pari a 1
mg, ma in termini di concentrazione sarà:
(1,98+1,00) (mg)
(100) (mL)
(1000) (mL/L) = 29,8 (mg/L o ppm)
29,8-20,0 = 9,8 ppm e non 10 ppm
(1,00) (mL) 1000 (mg/L)
= 10,0 (mg/L o ppm)
(100) (mL)
Lo stesso ragionamento può essere applicato ad es al matraccio 4, il cui
incremento in termini di concentrazione sarà:
(1,92+4,00) (mg)
(100) (mL)
(1000) (mL/L) = 59,2 (mg/L o ppm)
59,2-20,0 = 39,2 ppm e non 40 ppm
Possiamo però calcolare lo scarto % e vedere che per ogni matraccio
rimane costante:
Matraccio 1
9,8-10
10
100 = -2,0 %
Matraccio 4
39,2-40
40
100 = -2,0 %
b) Per evitare l’approssimazione del metodo precedente, si può aggiungere
in ogni matraccio un volume noto ed esatto Vx della soluzione dell’analita a
concentrazione incognita Cx e aliquote (in mL) di soluzione standard
crescenti indicate con n1, n2, n3, ecc…; alla fine si porta al volume finale Vt
(ad es. 100 mL) con un solvente opportuno.
A = K Cni con K = eb
n1 + Vx
n2 + Vx
n3 + Vx
n +V
4
x
Cni = concentrazione data dal
campione e da un’aggiunta
iesima dello standard.
V x Cx
A=K
A
Vt
Y = mx + q
A4
VxCx
A=K
Vt
A3
A2
A=0
0=K
VxCx
A1
Cx =
A0
nX
n1
n2
n3
n4
Vt
Cs
Vx
+
ni C s
+ K
Cs
+ K
(-nx)
Vt
Vt
Cs
Vt
ni
nx
Metodo delle aggiunte standard
Vantaggi e Svantaggi
Permette di effettuare l’analisi
quantitativa in matrici complesse
o incognite
Si può applicare a tutte le tecniche
analitiche sia spettrofotometriche,
elettrochimiche e cromatografiche
E’ necessario un a curva di
calibrazione per ogni analita da
determinare
E’ necessario un volume maggiore
rispetto a quello impiegato con la
retta di taratura con standard
esterno
E’ un metodo per estrapolazione,
teoricamente
meno
preciso
rispetto
al
metodo
di
interpolazione
della
retta
di
taratura con standard esterno
N.B.
Prima di effettuare la curva di
taratura o di applicare il metodo
delle
aggiunte
è
necessario
analizzare il bianco.
Il bianco ideale è costituito dalla
soluzione
conteente
tutti
i
componenti
il
campione
ad
eccezione dell’analita stesso.
In questo modo si può ottenere il
segnale
relativo
ad
una
“concentrazione zero” dell’analita.
0,5
1,0
1,5
2,0
Metodo dello standard interno
Questo metodo viene usato prevalentemente in cromatografia. Consiste nel
preparare una serie di soluzioni standard contenenti concentrazioni note e
variabili dell’analita e le stesse quantità di un’altra sostanza (standard
interno). Si costruisce una curva di calibrazione riportando in ascisse il
rapporto ponderale o di concentrazione dell’analita e dello standard (Pa/Pis o
[X]/[IS]) e in ordinate il rapporto delle aree (Aa/AIS).
Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno alla soluzione a
concentrazione incognita e si effettua la determinazione.
Dal rapporto delle aree si risale quindi tramite l’equazione della retta al
rapporto dei pesi o delle
concentrazioni.
AA/AI
Conoscendo la quantità
S
di standard interno
aggiunto, è possibile
risalire alla quantità di
analita.
0
[a]/[IS]
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
PA/PIS
PA/PIS si ricava per interpolazione dal grafico
QIS è la quantità di standard interno aggiunta (in peso)
Esempio
Se la quantità di standard interno aggiunta è 200 mg e il rapporto tra le
aree ottenuto dal cromatogramma è 1 per interpolazione dal grafico
precedente si ricava che il rapporto PA/PIS risulta essere 1,25.
Quindi dalla relazione sopra citata ricaviamo che la quantità di analita
sarà:
1,25 x 200 = 250 mg
Se poi vogliamo conoscere la concentrazione basta considerare il volume
di campione a cui è stato aggiunto lo standard.
PA
• Q IS
PIS
 CA
VC
Lo standard interno deve soddisfare certi requisiti:
-Non essere presente nella miscela da analizzare
-Essere ben risolto dagli altri componenti
-Avere un tr diverso ma non troppo lontano da quello dell’analita
-Essere strutturalmente simile al composto da analizzare in modo
che la risposta strumentale sia uguale o simile.
-Non contenere impurezze
-Non reagire con i vari componenti della miscela analizzata
Tipicamente i grafici dose/risposta approssimano una linea retta
Nella pratica, raramente tutti i dati sperimentali sono allineati
perfettamente lungo una linea retta; per questo occorre trovare la retta
migliore che interpola i punti sperimentali attraverso un’analisi di
regressione lineare usando il metodo dei minimi quadrati.
Viene cioè calcolata l’equazione della retta che minimizza la somma dei
quadrati delle distanze verticali tra i punti e la retta stessa.
L’equazione è chiamata equazione di regressione ed è del tipo y = mx + q
dove m, il coefficiente angolare, è chiamato coefficiente di regressione.
Tale retta, considerata la migliore, passa anche per il centroide o centro di
gravità che corrisponde al punto (Xmedio, Ymedio), valori corrispondenti ai
valori medi di tutti i dati sperimentali xi e yi.
.
Y
.
.
.
X
Per stabilire fino a che punto la retta trovata possa essere usata al fine di
prevedere un valore di Y conoscendo un determinato valore di X, e
viceversa, cioè per stabilire se la retta è realmente la migliore, si calcola il
coefficiente di determinazione o di correlazione lineare r2.
r2 può assumere valori in valore assoluto compresi tra 0 e 1.
Se r2 = 1 allora esiste una relazione lineare perfetta tra x e y, per cui ad
ogni valore di x corrisponde uno e un solo valore di y.
Se r2 = 0 allora non esiste alcuna relazione lineare tra x e y.
Valori compresi tra 0 e 1 indicano la “bontà” dell’equazione di regressione
calcolata.
Difficilmente le rette di calibrazione hanno valori di r2 inferiori a 0,98 e in
ogni caso mai al di sotto dello 0,95.
Determinazione quali-quantitativa
Resveratrolo
OH
HO
HO
Famiglia Fitoalexine
OH
-Forma trans
-Forma cis
-Forma glicosilata (3)
OH
OH
Antiossidante naturale presente
nell’uva, nel succo d’uva e nel vino
rosso
-GC-MS: derivatizzazione con bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetammide
-HPLC: in fase normale con eluizione isocratica o in fase inversa con
eluizione a gradiente
-Nel 1999 LC-MS (E.S.I.) in modalità di ione negativo (C18 – eluente:
MeOH/CH3COONH4 (55/45 v/v) 20mM)
-LC-MS (C.I.) in modalità di ione positivo (C18 – eluente: MeOH/HCOOH)
m/z=229 [M+H]+
Spettro di
frammentazione del
resveratrolo derivatizzato
ottenuto per C.I.
m/z = 444
(10 mg/L)
Spettro di
frammentazione del
resveratrolo ottenuto con
electro spray ionization
m/z = 227
(200 pg/L)
Determinazione per HPLC-UV del trans e cis resveratrolo in
preparazioni commerciali e sua stabilità alla luce e alla temperatura
-HPLC Gilson a due pompe con miscelatore
-Colonna C18 5 mM, lunghezza 250 mm, ID 4,6 mm
-eluizione isocratica
-eluente miscela acqua/acetonitrile
-Flusso 1 mL/min
-Prove eseguite in triplicato
-Iniezione di 20 mL
Scelta della l analitica
-Trans: 306 nm e 320nm
-Cis: 295 nm
Ottimizzazione % Acetonitrile
Conc. %
v/v
T(min)
T(min)
T(min)
media
K’
d.s.
log K’
20
26,06
25,932
25,899
25,96
0,085
10,74
1,03
25
12,969
12,99
12,971
12,977
0,0116
4,87
0,69
20 mL in triplicato di una
soluzione preparata
diluendo 100 mL della
soluzione Standard A in
matraccio da 100 mL
(5,53 mg/mL)
con metanolo
30
7,915
7,926
7,924
7,922
0,00586
2,6
0,41
Soluz. Standard A
10,53 mg/10 mL
35
5,662
5,661
5,467
5,657
0,00839
1,56
0,19
40
4,528
4,493
4,501
4,507
0,0183
1,04
0,02
Area 1
Area 2
Area 3
Area 4
media
µg/mL
d.s.
c.v.%
73473
78487
78508
77971
77448,2
2.63
2242.241
2.9
176717
165339
181583
171204
173912.8
5.26
6086.796
3.49
256045
264057
232595
256686
249043.4
7.90
13945.235
5.59
337036
347257
323089
325493
337031.8
10.53
12891.18
3.82
Retta di Calibrazione
Costruita da diluizione
Soluz. Standard A
25, 50, 75 e 100 mL
Portati a 10 mL con
metanolo
400000
y = 32475x - 4165,8
350000
2
R = 0,9985
media aree
300000
250000
200000 del trans-resveratrolo esposto a lampada
Stabilità
fluorescente
150000
100000
50000
0
0
2
4
6
conc (microg/mL)
8
10
12
1 buio
Area 2
Stabilità a -20 Area
°C al
µg/m
Area 3
Media
a t.a. con lampada
TStabilità
(h)
L
C%
40 Watt
169919
170317
185594
175276,7
0
5,53
100
152532
155695
155569
154598,7100
2
5,14
93
144593
149506
154731
149610
4
4,95
89,5
167122
138376
133066
146188
6
4,88
88,4
8
4,5
81,4
4,24
76,7
8
6
4
2
80
Conc %
Conc. (microg/mL)
10
60
40
134775
139712
132314
135600,3
123140
150
127316
200
132081
250
127512,3 0
20
0
0
50
100
12
0
Tempo (giorni)
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72
104440
110505
108410
107785
24
3,6
65,1
77743
80766
73183
77230,67
36
2,45
44,4
T (h)
Stabilità a t.a. con lampada
100 Watt
Stabilità a t.a. al buio
100
80
Conc%
Conc.(microg/mL)
10
8
6
60
40
4
20
2
0
0
0
0
50
100
150
Tempo (giorni)
200
250
10
20
30
40
T (h)
50
60
70
80
Stabilità a t.a. con lampada
UV 254 nm
100
Conc%
80
CONCLUSIONI
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
T (h)
Questa
si
verifica
sempre
quando la soluzione è esposta
a radiazioni provenienti da
fonti diverse.
Stabilità a t.a. con lampada
UV 365 nm
120
Inoltre
è
proporzionale
al
tempo di esposizione, alla
potenza e alla l usata.
100
80
Conc %
Il
trans-resveratrolo
è
risultato stabile sia a -20 °C che
a t.a. quando mantenuto al
riparo dalla luce, unica causa di
isomerizzazione.
60
40
20
0
0
50
100
150
T(m in)
200
250
300