Analisi cromatografica
su strato sottile
di coloranti alimentari
A cura di Federico Rusconi, dottorando dell'Università dell'Insubria
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Tecnica analitica (qualitativa) :
Cromatografia su strato sottile
Thin Layer Chromatography
T.L.C.
Materiale richiesto – Terminologia :
• “Lastrina”: supporto di vetro omogeneamente rivestito
di materiale adsorbente (silice)
• Camera di sviluppo
• Eluente opportunamente scelto
• Capillari per la deposizione delle soluzioni
• Campione da analizzare – Standards di riferimento
Scopo :
Individuare i coloranti impiegati in un determinaro alimento.
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Decreto Ministeriale del 31 marzo 1965 sulla "Disciplina degli additivi chimici consentiti
nella preparazione e per la conservazione delle sostanze alimentari", articolo 3:
"Sono considerati additivi chimici quelle sostanze, prive di potere nutritivo o impiegate
a scopo non nutritivo, che si aggiungono in qualsiasi fase di lavorazione alla massa o
alla superficie degli alimenti per conservare nel tempo le caratteristiche chimiche,
fisiche o fisico-chimiche, per evitare l'alterazione spontanea o per impartire ad essi,
oppure per esaltarne favorevolmente, particolari caratteristiche di aspetto, di sapore,
di odore o di consistenza".
Coloranti
Conservanti
Antiossidanti
Emulsionanti
Addensanti
Agenti gelificanti
Stabilizzanti
Esaltatori di sapidità
Acidi
Regolatori di acidità
Amidi modificati
Edulcoranti
…
I coloranti sono sostanze
che conferiscono un colore ad
un alimento o che ne restituiscono la
colorazione originaria, ed includono
componenti naturali dei prodotti alimentari
e altri elementi di origine naturale,
normalmente non consumati come
alimenti né usati come ingredienti
tipici degli alimenti.
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★
Coloranti Alimentari ( prima cifra della sigla: 1) :
I coloranti gialli e arancione: E100 - E111
I coloranti rossi: E120 - E129
I coloranti blu: E130 - E133
sono polveri colorate,
tipicamente solubili in acqua.
I coloranti verdi: E140 - E142
★ Esempi di strutture molecolari:
E132 : Indigotina
2,2'-Bi(2,3-dihydro-3-oxoindolylidene)-5,5'-disulfonic acid disodium salt
E131 : Blue Patent V
E102 : Tartrazina
4,5-dihydro-5-oxo-1-(4-sulfophenyl)-4-[(4-sulfophenyl)azo]
-1H-Pyrazole-3-carboxylic acid, trisodium salt
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Ethanaminium, N-[4-[[4-(diethylamino)phenyl](2,4-disulfophenyl)methylene]
-2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethyl-, inner salt, sodium salt
Cos’è la Cromatografia ?
E’ la tecnica più diffusa ed efficiente per la separazione analitica
di diversi componenti di una miscela.
Grazie alle sue notevoli potenzialità trova applicazione in tutte le branche
della scienza. In molti casi, i prodotti organici che si formano in una
reazione chimica –oppure che sono presenti in una matrice naturalenon possono essere separati o purificati tramite
• estrazione con solvente
• ricristallizzazione
• distillazione
perché le proprietà chimico-fisiche dei componeti sono troppo simili tra loro,
e le differenze non sono apprezzabili e tali da consentire la separazione.
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Come e quando fu scoperta ?
Nel 1906 il biochimico Mikhail Tswett adottò questa tecnica per separare
i vari pigmenti di un estratto vegetale.
CROMATOGRAFIA =
κρόμα
“colore”
+
γράφειν
“scrivere”
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La cromatografia può essere definita
come la separazione di una miscela
in varie frazioni per distribuzione dei
componenti tra due FASI tra loro immiscibili :
FASE STAZIONARIA (immobile)
FASE MOBILE
► A seconda del tipo di fase mobile e fase stazionaria, è possibile classificare:
► Inoltre, a seconda della modalità fisica mediante la quale è assicurato il contatto
tra la fase mobile e quella stazionaria, si hanno:
Cromatografia
su colonna
Cromatografia
planare
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La tecnica sperimentale prevede
la dissoluzione della miscela campione
in una fase mobile (liquida o gassosa).
La fase mobile viene fatta passare
attraverso una fase stazionaria
(generalmente un solido o un gel)
posto in una colonna
o su una superficie solida
FASE STAZIONARIA
La miscela da separare è “trascinata”
dalla fase mobile in modo dinamico:
il componente della miscela che
interagisce di più con la fase stazionaria
è quello che viene RITARDATO di più,
e viceversa.
Ovvero la separazione è possibile nel
momento in cui i diversi componenti
tendono a ripartirsi in modo diverso fra
le due fasi, in funzione del loro grado
8 di
affinità con ciascuna di esse!
TLC : cromatografia planare
tempo
tempo
L’importanza della TLC è dovuta a :
• basso costo
• velocità con cui è possibile eseguire separazione cromatografica
• possibilità di scegliere un opportuno solvente (eluente) che poi verrà utilizzato
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per la colonna cromatografia su colonna, dunque su più larga scala
Come si esegue una TLC
Tracciare la linea di partenza (linea di deposizione) con una matita
Per mezzo di un capillare deporre alcune gocce delle soluzioni delle
diverse sostanze
Si pone la lastrina nella camera di eluizione contenente la miscela
eluente opportuna
Si nota che il solvente sale per capillarità lungo la fase stazionaria
Quando il solvente ha raggiunto i bordo superiore della lastrina,
la si estrae e si segna a matita il “fronte del solvente”
Si analizza la lastrina con un opportuno metodo:
• analisi visiva
• esame della lastrina sotto lampada UV
• lastrina immersa in reattivi tali da colorare le macchie
-e non la fase stazionaria- (H2SO4, vapori di iodio, ninidrina, …)
Valutazione degli Rf
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Cos’è il fattore di ritenzione Rf
distanza percorsa dal solvente
Rf (A)
Rf (B)
=
=
d (A)
d solv
d (B)
B
A
d (A)
=
d (B)
Rf
distanza percorsa dalla sostanza
distanza percorsa dall solvente
Per ogni composto:
d solv
Il valore di Rf di un composto è una costante fisica, per quelle determinate
condizioni cromatografiche di eluente e fase stazionaria, e può servire a
caratterizzare quel composto.
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Procedura sperimentale
La fase di estrazione è così eseguita:
Si lavano 5-6 caramelle di colore verde in circa 4ml di H2O a temperatura ambiente. La sospensione
verde presenta una parte solida derivante dall’agente di rivestimento (cera di carnauba) : esso viene
allontanato tramite filtrazione. Eventualmente la soluzione ottenuta è concentrata per evaporazione.
Di ciascuno dei quattro coloranti puri ( E102, E104, E131, E132) a disposizione, si prepara la
rispettiva soluzione acquosa; si ottengono così le quattro soluzioni di riferimento.
L’eluente è costituito da una miscela di solventi, ed è così preparato:
25ml di n-butanolo
25ml di etanolo
12,5ml di H2O
5ml di NH3 al 25%
Sulla lastrina vengono depositati i quattro standard di riferimento, e la soluzione campione.
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