Estrazione ed analisi dei lipidi
Lezione del 17- 5- 07
Estrazione dei lipidi (Bligh & Dyer)
CELLULE o MEMBRANE
in soluzione fisiologica
+
CH3OH
Agitazione per 15’
+
CHCl3
Agitazione per 15’
centrifuga
SISTEMA MONOFASICO
H2O/CH3OH/CHCl3
0,8
2
1
SN1
+
pellet
centrifuga
SN2
CHCl3 + H2O
+
CH3OH / CHCl3 / H2O
1
1
0,9
CH3OH+H2O
SN1+SN2
CHCl3
SISTEMA BIFASICO
ESTRATTO
LIPIDICO
H2O /CH3OH/ CHCl3
0,8
2
1
Cos’e’ la Cromatografia ?
La cromatografia e’ una tecnica che serve a separare i singoli
componenti di una miscela omogenea.
E’ basato sulla diversa ripartizione di molecole tra una fase
mobile (liquida o gassosa) ed una fase stazionaria (solida o
liquida)
• Analisi
qualitativa
• Analisi
quantitativa
• Purificazione
Miscela
Componenti
Differenti tipi di cromatografia
• Cromatografia liquida ( cromatografia su colonna, su
strato sottile o TLC, e HPLC)
– Fase stazionaria: gel di silice, allumina, etc.
– Fase mobile: solventi organici
– importanti proprieta’: polarita’
• Gas cromatografia
– Fase stazionaria: un polimero impaccato o capillare.
– Fase mobile: gas inerte (Elio)
– importanti proprieta’: punto di ebollizione (evaporazione
soluti)
Cromatografia su strato sottile (TLC)
Il gel di silice o di allumina (fase stazionaria) e’ deposto in strato sottile su una lastra di
vetro. La silice e’ molto polare.
La superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (SiOH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si). Sui primi ha luogo l’interazione tra fase fissa e
soluto
Si
OH
Si
O
OH
O
Si
Si
O
OH
Si
Si
O
O
O
O
La silice è resa attiva dai gruppi silanolici ≡Si-OH. Questi, però, sono bloccati da
molecole di acqua legate mediante legami idrogeno
H
Si
O
H
HO
Quindi, è necessario essiccare in stufa ( 180 °C) per eliminare le molecole di acqua,
senza però superare i 300 °C, perché si avrebbe la condensazione interna con
formazione nuovamente di gruppi silossanici
+
Si
OH
Si
HO
Si
Si
+
H2O
O
La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere, con il soluto, per
l’adsorbimento sulla fase stazionaria. L’effetto della fase mobile è quello di
differenziare la capacità dei vari soluti di essere adsorbiti. Un soluto molto polare
interagisce fortemente con la fase fissa e, per far si che la fase mobile competa con il
soluto, dovra’ anch’essa essere abbastanza polare.
Affinità di classi di composti
con fasi stazionarie polari
Composto
fosfolipidi
Gruppo
funzionale
O
O
Acidi
O
C
H2C
O
C
R2
OH
Alcoli
R1
OH
Ammine
O
CH
H2C
NH2
Mercaptani
C
O
O
O
X
O
SH
glycerophospholipid
H
Aldeidi
P
C
O
Chetoni
C
Esteri
C
O
O
R
O
O
Eteri
R
H
Alcheni
C
C
H
Alcani
R
forza di assorbimento
crescente
R1, R2= catene acidi grassi non polari
Glicerolo, gruppi fosfato e X = parte polare
O
O
R
C
O
CH2
R'
C
O
CH
O
H2C
O
O
P
H
O
CH2
O-
C
NH3+
R
C
O
CH2
R'
C
O
CH
H2C
O
O
O
P
O
CH2
CH2
NH3+
O-
COO-
Fosfatidiletanolammina
Fosfatidilserina
O
O
R
C
O
CH2
R'
C
O
CH
O
H2C
O
O
P
OH
O
CH2
CH2
N+(CH3)3
OH
H
O-
O
H
OH
H
H
H
OH
HO
Fosfatidilcolina
O
P
O
CH2
O
C
R
CH
O
C
R'
CH2
O
OH
Fosfatidilinositolo
Cromatografia su strato sottile (TLC)
• Applicazione del campione
• Corsa cromatografica
• Visualizzazione
• Interpretazione dei risultati
1. Applicazione del campione
A. Disegnare la linea di deposizione
e il fronte del solvente con una
matita
“fronte del solvente”
 1 cm.
B. Risospendere i campioni in
cloroformio
C. Depositare il campione mediante
capillari o siringhe tipo Hamilton
“linea di deposizione”
 1 cm.
2. Corsa cromatografica
A. La lastra viene posta in una
vaschetta chiusa saturata dai
vapori del solvente di sviluppo
Lastra cromatografica
B. Il campione viene trasportato
attraverso la fase stazionaria
C. Rimuovere la lastra dalla cameretta
quando il solvente ha raggiunto la
linea superiore
}
Solvente di
sviluppo
(fase mobile)
Camera di slivuppo
3. Visualizzazione dei risultati
A. Attendere l’evaporazione del solvente
dalla superficie della lastra
B. Per rilevare la posizione dei componenti
esistono metodi chimici e metodi fisici
C. Un metodo fisico si basa sull’osservazione
della lastra alla luce ultravioletta (254 nm
365 nm). I metodi chimici consistono nello
spruzzare sulla lastra reagenti cromogeni
come soluzioni di H2SO4, di iodio, blu
di molibdeno ecc..
4. Interpretazione dei risultati
A. Determinare il fattore di ritenzione (Rf)
per ciascuna macchia.
Rf =
distanza tra macchia e linea di deposizione
distanza tra il fronte del solvente e linea di deposizione
dA
Rf componente A = d
S
Rf componente B =
dB
dS
B. I componenti incogniti vengono
identificati per confronto con gli
Rf degli standard .
?
- - - - - - - - - - - - - - - - - - 1- - - - - - - - - - - - -
dc
?
- - - - - - - - - - - - - - - - - - -2- - - - - - - -
dB
?
- - - - - - - - - - - - - - - - - - -3- - - -
dA
miscela
incognita
std
std
std
dS
Fronte del solvente
component B
- polare!
component A
+ polare!
Fronte del solvente
componente B
componente A
Miscela
incognita
Linea di deposizione
Linea di deposizione
Corsa cromatografica
I componenti meno polari presentano una minore interazione con la silice e migrano piu’
velocemente
I componenti piu’ polari stabiliscono maggiori interazioni con la silice e migrano piu’
lentamente
I componenti neutri migrano con il fronte del solvente
TLC preparativa (purificazione dei singoli componenti)
BPG
Scraping della silice
PG
PGP-Me
PGS
GlyC
S-TGD-1
Estrazione dei lipidi
(Bligh & Dyer)
Analisi quantitativa
Retta di calibrazione
18
16
area macchia
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
microgrammi
8
10