ESERCITAZIONE DI FISIOLOGIA ANIMALE
L’esercitazione è suddivisa in due fasi:
Estrazione dei lipidi di membrana (Bligh & Dyer)
Analisi del profilo lipidico mediante:
CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)
MALDI-TOF
ESTRAZIONE DEI LIPIDI DI MEMBRANA
(metodo di Bligh & Dyer)
- Si parte da un’aliquota di coltura cellulare di 0.8 ml, in provetta da centrifuga
- Aggiungere 2 ml di CH3OH e agitare gentilmente per 15 min (denaturazione delle proteine)
- Aggiungere 1 ml di CHCl3 e agitare per 15 min (ripartizione dei lipidi nella fase organica): si nota la precipitazione delle proteine
denaturate bianche.
MONOFASE
Il rapporto dei solventi è: H2O/CH3OH/CHCl3 = 0,8/2/1
Centrifuga: 3500 rpm x 10 min
SN
Pellet
BIFASE: 0.9:1:1 H2O/ CHCl3 /CH3OH
- Aggiungere 1 ml di CHCl3 e 1
ml di KCl 0.2M
Fase metanolo acqua
Fase cloroformio-lipidi
-Attendere la separazione tra fase acqua/metanolo (superiore incolore) e fase cloroformio. Nella fase cloroformio sono solubilizzati i lipidi;
mentre la proteina denaturata si dispone all’interfase.
- Raccogliere la fase cloroformio in un’altra provetta.
- Portare a secco i lipidi disciolti nella fase cloroformio sotto flusso di N2.
- I lipidi possono essere pesati e risospesi in un piccolo volume di CHCl3. Infine, l’estratto lipidico può essere analizzato mediante TLC.
Preparazione di una lastra per TLC
Linea del fronte
7.5 cm
0,5 cm
Linea di deposizione
1 cm
1 cm
pozzetto
spazio tra due pozzetti
Lavaggio della lastra con CHCl3/CH3OH (1:1)
Attivazione in stufa 180 °C per 2 h
Estrazione dei lipidi ( Bligh &Dyer)
Allestimento bancone:
Pipette graduate in vetro
Pipette Pasteur in vetro
Provette in vetro pirex (vol=15 ml)
Palla di Peleo
Carta da bancone
Agitatore di provette
Centrifuga
Occorrente:
Coltura cellulare di Salinibacter ruber, Halobacterium salinarum
CHCl3 (cloroformio)
CH3OH (metanolo)
H2O bidistillata
KCl 0.2M (cloruro di potassio)
Cromatografia su strato sottile
Occorrente:
Lastre in vetro ricoperte da silice (Merck 20x10 cm, spessore 0,2 mm)
Microsiringhe Hamilton (5-10 µl)
Cameretta cromatografica
Cilindri in vetro
Solventi organici
Carta da bancone
Solventi da preparare:
Russel acido: CHCl3/CH3OH/CH3COOH/H2O (85/15/10/3.5 vol/vol)
Solvente A : CHCl3/CH3OH/CH3COOH (65/30/4 vol/vol)