HER2Club
in gastric cancer
La valutazione dello stato di HER2: immunoistochimica ed
ibridazione in situ
Roberto Fiocca
Due metodiche differenti sono comunemente utilizzate per la valutazione dello stato di HER2:
l’immunoistochimica (IHC) e l’ibridazione in situ (ISH), nelle varianti fluorescente (FISH) o
cromogenica (CISH/SISH). L’impiego combinato di IHC e ISH è previsto e richiesto dalle linee
guida/raccomandazioni edite dalle società scientifiche e dalle autorità regolatorie (1-3).
Mentre IHC valuta il grado di espressione della proteina HER2, la ISH riconosce il livello di
amplificazione del gene che codifica per HER2. Come precedentemente sottolineato, l’IHC è
considerata il test di prima scelta per la valutazione iniziale dello status di HER2 nel carcinoma
gastrico mentre le tecniche FISH/CISH sono da riservarsi ai casi “equivoci” in IHC (1,2).
Valutazione immunoistochimica dell’espressione di HER2
La valutazione dell’espressione di HER2 viene condotta prendendo in considerazione esclusivamente
la positività a carico della membrana cellulare, essendo la sola positività citoplasmatica di regola
espressione di artefatti tecnici. La graduazione dell’intensità di espressione IHC si basa sulla
valutazione dell’intensità dell’immunocolorazione: essa è quindi inevitabilmente gravata da un
fattore “riproducibilità”, legato alla soggettività dell’osservatore. Tale problema può essere in parte
limitato laddove venga praticata una standardizzazione delle metodiche di laboratorio (compresa
la fase pre-analitica) e si seguano criteri definiti per la graduazione microscopica dell’intensità
dell’immunocolorazione. In linea generale, i casi con score IHC 0 e 3+ non pongono significativi
problemi di interpretazione mentre una maggiore variabilità inter-osservatore è attesa nei casi
con score IHC 1+ e 2+: tale variabilità è insita nella definizione stessa dello score 1+ (reattività
di membrana lieve/appena percettibile) e dello score 2+ (reattività di membrana da debole a
moderata) – la differenza stessa tra faint e weak in inglese è ambigua. Tale variabilità costituisce un
potenziale problema nella definizione a scopo predittivo dello status di HER2, in quanto secondo le
raccomandazioni correnti (2,3) i casi con score 1+ sono considerati negativi mentre quelli con score
2+ sono considerati “equivoci” e quindi meritevoli di una valutazione combinata IHC+ISH (Fig.1). Una
proposta pratica per “standardizzare” il reporting di HER2 è stata avanzata dal German–French ring
study (4): essa prevede che un’intensa HER2-positività (IHC 3+) sia visualizzabile inequivocabilmente
come colorazione di membrana già a basso ingrandimento (× 2,5/x5 ) mentre il riconoscimento
inequivoco di una positività IHC 2+ richieda un’osservazione ad ingrandimento intermedio (x 10/x
Con il contributo educazionale di
20) e che uno score IHC 1+ sia individuabile solo con un’osservazione ad alto ingrandimento (×
40) (Fig. 2). Tale approccio (denominato “magnification rule”) consente di incrementare il livello di
riproducibilità (4).
Valutazione dell’amplificazione del gene HER2 con l’ibridazione in situ (ISH)
La ISH viene considerata principalmente come metodica di valutazione di II° livello, in accordo con
le linee guida internazionali e nazionali (1,2), da utilizzare dopo l’immunoistochimica, per dirimere
quei casi in cui la determinazione IHC abbia fornito risultati equivoci (score 2+). L’indagine ISH nei
casi con score IHC 1+ può essere presa in considerazione, data la difficoltà di definire i tumori IHC
1+ e differenziarli da quelli 2+ (2,5): in questi casi la definizione dello stato di HER2, in funzione della
terapia con trastuzumab, deve essere discussa individualmente con l’oncologo.
Le tecniche “dual color”, che utilizzano due fluorocromi o due cromogeni diversi per visualizzare
sullo stesso preparato istologico la regione centromerica del cromosoma 17 (sonda CEP 17) ed il
numero di copie del gene HER2, sono quelle più utilizzate e consigliabili (Fig. 3) (2). La FISH, pur
restando la tecnica di riferimento, presenta alcune criticità: essa necessità di attrezzature costose e
dedicate, un training specifico del lettore, il fluorocromo è soggetto a decadimento con impossibilità
di conservazione a lungo termine dei preparati e l’assenza del dettaglio morfologico non consente
un confronto con IHC. Per ovviare ad alcune di queste problematiche, sono state introdotte
metodiche di ibridazione in situ in campo chiaro (CISH e SISH) che prevedono, quindi, l’utilizzo
di un normale microscopio ottico, consentono una migliore correlazione tra aspetti morfologici e
risultato della ISH e permettono una conservazione dei preparati a lungo termine.
La definizione dell’amplificazione deve comprendere il rapporto tra segnali del gene HER2/segnali
centromerici del cromosoma 17: è definito come amplificato un rapporto > 2/nucleo. I criteri per la
definizione dello stato di amplificazione del gene HER2 (ISH) sono analoghi a quelli utilizzati per il
carcinoma mammario.
Dato che nei casi IHC 3+ è attesa una quasi assoluta correlazione dei test IHC vs FISH, è opportuno
che ciascun laboratorio provveda a validare una quota parte della casistica valutata in IHC con
ibridazione in situ, ottenendo una concordanza non inferiore al 90% nei casi 3+ (2).
Campione tumorale
IHC
0
+1
+2
+3
ISH
-
+
Eleggibile per trastuzumab
Fig. 1 Algoritmo per valutazione HER2 nel carcinoma gastrico
Con il contributo educazionale di
a
b
c
Fig. 2 Espressione IHC di HER2, criteri di score IHC secondo il “magnification rule”: a) un caso 3+ è facilmente riconoscibile a basso
ingrandimento; b) una posività moderata (score 2+) è apprezzabile ad ingrandimento intermedio mentre c) una lieve positivitità di
membrana (score 1+) è riconoscibile solo ad alto ingrandimento. Immunoistochimica con anticorpo anti-HER2/neu (4B5) Ventana/Roche.
Fig. 3 Ibridazione in situ fluorescente
(FISH) con sonde “dual color”: un caso
di carcinoma gastrico non amplificato
(a) ed uno con amplificazione (b), in
cui il numero di spot relativi al gene
HER2/neu (spot rossi) è largamente
superiore a quelli del centromero del
cromosoma 17 (spot verdi).
Bibliografia essenziale
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Con il contributo educazionale di