LIMITI TECNICI NEL CONFRONTO FRA
SEZIONAMENTO MULTI-STEP,
IMMUNOCITOCHIMICA E RT-PCR
NELL'ANALISI DEI LINFONODI SENTINELLA
DI CARCINOMA DELLA MAMMELLA. UNO
STUDIO CONDOTTO SU TESSUTI FISSATI
IN METHACARN.
Lorenzo Daniele, Laura Annaratone, Elena Allia,
Sara Mariani, Enrico Armando, Martino Bosco,
Luigia Macrì, Paola Cassoni, Giuseppe D’Armento,
Gianni Bussolati, Gabor Cserni and Anna Sapino
Analisi isto-patologica dei linfonodi
sentinella (LNS) di carcinoma mammario
PROCEDURE “RACCOMANDATE”:
i- valutazione istologica multi-livello
ii- analisi immunocitochimica (IHC)
PROCEDURE “ALTERNATIVE”:
iii- RT-PCR
….tuttavia, studi generalmente effettuati su:
metà LNS (fissato in
formalina e incluso in
paraffina)
Colorazione con ematossilina
ed eosina (EE) e IHC
metà LNS (tessuto
fresco o congelato)
RT-PCR
….IMPOSSIBILE CONFRONTO DIRETTO DEI
RISULTATI
Fissativi alternativi alla
formalina:
METHACARN
• 60% METHANOL
• 30% CHLOROFORM
• 10% ACETIC ACID
NEL NOSTRO STUDIO
utilizzando una casistica di LNS
fissati in Methacarn messo a punto un
protocollo di sezionamento a step
successivi (“multi-step sectioning”) a
intervalli di 100 micron
confronto diretto di EE, IHC e RT-PCR sulle
stesse sezioni di LNS
Materiali e metodi
• 74 LNS fissati in Methacarn
• Sezionamento “multi-step”
• Prime due sezioni consecutive di ciascun livello
(spessore 4 µm): EE e IHC (AE1/AE3)
• Sei sezioni (spessore 7 µm), livelli 4-5: RT-PCR
(Mammaglobin, CK19 e CEA)
Risultati
• RNA estratto con successo in 69/74 LNS
• EE/IHC:
7 macrometastasi, 2 micrometastasi e 7 cellule tumorali
isolate
• RT-PCR:
i- positiva per CEA/CK19/mammaglobin in 6/7
macrometastasi e in 1/2 micrometastasi
ii- positiva per CEA e/o CK19 in 3/7 cellule tumorali
isolate e in 23 casi negativi per EE/IHC
iii- Nei 2 casi negativi per RT-PCR presenza di metastasi
riscontrata in sezioni situate distalmente rispetto a quelle
analizzate con RT-PCR
mRNA per CK19, CEA e
Mammaglobin non rilevato nelle
sezioni dei livelli da 4 a 5
mRNA per CK19, CEA e
Mammaglobin rilevato nelle
sezioni dei livelli da 17 a 20
Discussione e Conclusioni
• Analisi istopatologica, IHC e RT-PCR:
indagini non paragonabili se eseguite su
porzioni differenti del linfonodo sentinella
discrepanze fra indagine molecolare e
analisi morfologica
• Studi prospettici con analisi quantitativa
dell’RNA potranno chiarire l’utilità dell’analisi
molecolare effettuata su linfonodi sentinella
Da Daniele et al. Journal of cellular and molecular medicine, 2008