DOPPIA COLORAZIONE
IMMUNOCITOCHIMICA
AUTOMATIZZATA
M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani,
e G.Zamboni
Servizio di Anatomia Patologica,
Ospedale S.Cuore – Don Calabria di Negrar (VR)
INTRODUZIONE
L’ESAME CITOLOGICO è una metodica di ampio utilizzo.
Il suo potenziale diagnostico è affinato dall’ applicazione
di procedure immunocitochimiche (ICC).
PROBLEMA: limitato numero di preparati disponibili.
SOLUZIONE:
- divisione del preparato in più aree
- doppia colorazione ICC
INTRODUZIONE
La DOPPIA COLORAZIONE ICC utilizza due anticorpi
sulle stesse cellule contemporaneamente.
RISULTATO: visualizzazione di due anticorpi diversi sulle
medesime cellule.
La STANDARDIZZAZIONE della metodica con l’utilizzo di
un IMMUNOCOLORATORE la rende eseguibile in 3.5 ore.
MATERIALE
LA DOPPIA COLORAZIONE ICC É APPLICABILE A:
• materiale citologico strisciato ottenuto per agoaspirazione
• citocentrifugato di liquido endocavitario o endocistico
• materiale citologico in fase liquida
Fissazione immediata del materiale dopo l’allestimento in
alcool etilico 95° per almeno 15 minuti.
METODI
VARIABILI nella STANDARDIZZAZIONE AUTOMATIZZATA
della metodica:
• materiale e fissazione
• scelta degli anticorpi da abbinare
• recupero antigenico combinato per i due anticorpi
• denaturazione di eventuali legami aspecifici
METODI
PROTOCOLLO DI ESECUZIONE
1. Eventuale recupero antigenico
2. Incubazione del primo anticorpo
3. Rivelazione con multimero coniugato con perossidasi
4. Sviluppo con cromogeno DAB.
5. Denaturazione a 90°C per 4 minuti
6. Incubazione del secondo anticorpo
7. Rivelazione con multimero coniugato con fosfatasi
8. Sviluppo con cromogeno FAST RED.
METODI
ANTICORPI UTILIZZABILI CONTEMPORANEAMENTE:
- Anticorpi diretti contro antigeni presenti su cellule di
diversa origine e mutuamente esclusivi.
- Anticorpi diretti contro antigeni presenti sulla stessa
cellula ma con localizzazione differente (nucleare,
citoplasmatica, di membrana).
APPLICAZIONI
- Metastasi (linfonodale, epatica, polmonare) di origine
sconosciuta combinando: CD45-Pan Citocheratina;
antiEpatocitario-CK7;
TTF1-CK20;
CDX2-ER.
Metastasi linfonodale di carcinoma a piccole cellule
CD45
PAN CK
APPLICAZIONI
- Metastasi (linfonodale, epatica, polmonare) di origine
sconosciuta combinando: CD45-Pan Citocheratina;
antiEpatocitario-CK7;
TTF1-CK20;
CDX2-ER.
Metastasi epatica di adenocarcinoma del polmone
antiEpatocyte
CK7
APPLICAZIONI
- Tipizzazione di carcinomi primitivi del polmone con:
TTF1-CK7; P63-Sinaptofisina.
Adenocarcinoma primitivo del polmone
TTF-1
CK7
APPLICAZIONI
- Diagnosi di processi linfoproliferativi con: CD3-CD20;
Ciclina D1-CD5 e BCL6-CD23.
B-CLL (evidente infiltrato linfoide B)
CD3
CD20
APPLICAZIONI
- Diagnosi di processi linfoproliferativi con: CD3-CD20;
Ciclina D1-CD5 e BCL6-CD23.
B-CLL (evidente infiltrato linfoide B CD5+)
CD5
CD5+CD3
APPLICAZIONI
- Discriminazione tra cellule epiteliali e mesoteliali in
liquidi pleurici/peritoneali con: BerEP4(ESA)- Calretinina.
Liquido pleurico da metastasi di carcinoma mammario
BerEp4
Calretinina
CONCLUSIONE
La STANDARIZZAZIONE AUTOMATIZZATA
della
DOPPIA COLORAZIONE ICC ha reso la metodica ancora
più facile e meno dispendiosa in termini di:
- tempo
- personale
- materiale cellulare impiegato