ANTICORPI
Il termine anticorpo si riferisce alla proprietà di riconoscere in maniera specifica i “corpi
estranei” (antigeni).
H
L
H
Fab
L
Fab
Fc
Vari frammenti proteici degli anticorpi possono essere utilizzabili in diverse circostanze e
vengono prodotti individualmente mediante proteolisi enzimatica oppure con le tecniche del
DNA ricombinante. Le piccole dimensioni migliorano le proprietà di diffusione e penetrazione
(es. marcatori tissutali).
Modifiche post-traduzionali e ponti disolfuro sono fondamentali per l’attività delle molecole
anticorpali quindi è importante la modalità di produzione e purificazione degli anticorpi stessi.
… GLOSSARIO
Antisiero policlonale: miscela eterogenea di anticorpi che si trova nel siero derivato da un
animale immunizzato.
Anticorpo monoclonale: anticorpo prodotto da una linea cellulare clonale in coltura. Ben
definito e con caratteristiche prevedibili.
Anticorpi umanizzati: anticorpi murini in cui molte sequenze di topo sono sostituite con
omologhe sequenze umane al fine di ridurre l’immunogenicità degli anticorpi monoclonali
nell’uomo.
PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI.
Tipizzazione tissutale
Analisi sierologiche
Reagenti precisi
per ricerca
Trattamento malattie
autoimmuni
Manipolazione
risposte immunitarie
Diagnosi ed epidemiologia
agenti infettivi
Applicazioni
degli anticorpi monoclonali
Identificazione dei prodotti
dei geni oncogeni
Potenziamento del
rigetto tumorale
Purificazione sostanZe
presenti in microquantità
Diagnostica tumori e
metastasi in vivo
Le potenziali applicazioni degli anticorpi monoclonali rappresentano ad oggi uno dei settori
cardini delle biotecnologie, che possono essere ulteriormente sviluppate mediante le tecniche da
DNA ricombinante grazie alla produzione di anticorpi con nuove funzioni effettrici, i cosidetti
immunoconiugati .
Anticorpi monoclonali umanizzati vs Anticorpi monoclonali murini
Perchè un anticorpo monoclonale sviluppi appieno il suo potenziale terapeutico sull'uomo, è
indispensabile che sia di origine umana. Questo ovviamente perchè l'anticorpo è esso stesso
un antigene.
Anticorpi monoclonali murini → complessa risposta anti-topo (produzione HAMA) → ↓
potenziale terapeutico e fenomeni di ipersensibiblità nell’uomo → no immunoterapia!
Strategia → anticorpi chimerici uomo-topo, prodotti per ricombinazione a livello genico dei
domini variabili murini, corrispondenti alla specificità selezionata, con domini costanti umani
→ anticorpi umanizzati → scelta dell’isotipo a seconda dell'utilizzo clinico e nessuna risposta
immunitaria della regione costante umana → produzione laboriosa e richieste grandi quantità.
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DA IBRIDOMI
Topo inoculato con l’antigene
opportuno
Plasmacellule
isolate dalla
milza
Cellule di mieloma
coltivate in vitro
Fusione cellulare in
presenza di PEG
Selezione e
clonaggio degli
Cloni che
ibridomi milzaproducono
mieloma
un unico tipo di
anticorpo
Anticorpi
monoclonali
dal terreno di
coltura
LINEE CELLULARI DI MIELOMA
• Nessuna produzione immunoglobuline.
• Mancata espressione del gene per l’enzima HGPRT
(ipoxantina guanina fosforibosil transferasi) coinvolto
nel metabolismo dei nucelotidi.
•SELEZIONE DEGLI IBRIDOMI
E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli ibridomi
siano capaci di sintetizzare il DNA.
↓
SISTEMA HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina)
Condizioni di coltura in cui solo le cellule ibride riescono a
sintetizzare il DNA e percio' ad andare incontro a divisioni
cellulari. Le cellule non ibride sono incapaci di sintetizzare DNA e
vanno perse. La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di
NTP (deossipurin- e pirimidin- trifosfati) sintetizzati a partire dai
rispettivi monofosfati.
I NTP si formano da:
SINTESI DE NOVO → dai precursori più semplici
VIE DI SALVATAGGIO → gli enzimi riciclano purine e pirimidine
prodotte dalla degradazione di DNA e RNA.
HAT: H=ipoxantina
L'ipoxantina è usata come una sorgente esterna di purine poichè essa è fosforilata dall'enzima
ipoxantina guanina fosforibosil transferasi (HGPRT) a formare IMP che, alternativamente, può
essere convertito a AMP e GMP.
(HGPRT)
Enzima assente nelle cells mieloma
↓
Unica via = sintesi de novo dei nucleotidi
(IMP)
↓
↓
AMP,GMP
HAT: A= aminopterina
L'aminopterina blocca tutte le reazioni dell'enzima diidrofolato reduttasi che è coinvolto nella
sintesi de novo di IMP (e di qui tutte le purine) e anche nella metilazione di dUMP a formare
dTMP. Di conseguenza, la cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per
produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA.
•METILAZIONE dUMP A dTMP
dUMP
Timidilato Sintasi
PLP
dTMP
DHPR ×
Tetraidrofolato
↓ (coenzima)
↓
↓
•SINTESI DE NOVO IMP E PURINE AMP←IMP→GMP
← Aminopterina
HAT: T=timidina
La timidina usata come sorgente esterna, è fosforilata dalla timidina chinasi (TK) per
formare TMP.
TK
+ ATP
→
+ ADP
TK: timidina chinasi
Timidina
TMP
… riepilogando
Le cellule ibride formate per fusione di plasmacellule con cellule di mieloma hanno la sintesi de
novo bloccata da aminopterina ma grazie ai cromosomi di topo hanno l'HGPRT e possono
recuperare le purine per formare purin monofosfati dall'ipoxantina, e grazie a TK possono
sintetizzare dalla timidina i pirimidin monofosfati. Quindi solo queste cellule ibride riescono a
crescere e a dividersi in presenza di HAT.
HGPRT
MUOIONO
in HAT
Cell Mieloma
Milza-mieloma
Cell Milza
Le plasmacellule
MUOIONO
per apoptosi
SOPRAVVIVONO
solo le cell IBRIDE
che hanno ricevuto dal topo
il gene per l’enzima HGPRT
Es. ELISA
Verifica della positività
1.
Titolo
anticorpale
immunizzazione
basso:
nuova
2.
Titolo anticorpale alto: propagazione ibridomi
Sistemi selettivi per l’isolamento di ibridomi:
clonaggio su feeder layer
Scopo = ottenimento di colture cellulari provenienti dall’espansione
clonale di una singola cellula.
Feeder layer: Cellule di supporto (es. macrofagi murini) con la funzione
di condizionare il terreno di coltura e permettere la crescita di ibridomi in
condizioni di bassa concentrazione.
•Clonaggio in agar
•Clonaggio in diluizione limite
Sistemi selettivi per l’isolamento di ibridomi:
clonaggio su feeder layer in agar
Semina su agar di singole cellule di ibridoma (diluizioni) con la
propagazione dei singoli cloni visualizzati al microscopio. Ottenuta la
crescita clonale per stratificazione con antisiero specifico si formerà un
immunoprecipitato intorno ai singoli cloni che ne consentirà il prelievo.
Sistemi selettivi per l’isolamento di ibridomi:
clonaggio su feeder layer in diluizione limite
Mediante microscopia in piastre a 96 pozzetti il clone madre è diluito
(circa 60 cells per piastra ossia 1-5 cells per pozzetto) e distribuito. Dopo
3 giorni si osserva la presenza di piccoli cloni di cellule di ibridomi in
ciascun singolo pozzetto (elevata possibilità di origine dei cloni da
un’unica cellula).
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DA COLTURE
DI CELLULE ANIMALI
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DA COLTURE
DI CELLULE ANIMALI
1.
Immunizzazione dell’animale con l’antigene specifico
2.
Formazione e selezione degli ibridomi (mieloma cells/milza cells)
3.
4.
1.
Terreno HAT
2.
Crescita 10-14 giorni (sopravvivenza dei soli ibridomi)
3.
Trasferimento in coltura –HAT
Identificazione delle cellule ibride che producono l’anticorpo specifico
1.
Immunodosaggio (ELISA assay)
2.
Isolamento degli ibridomi (feeder layer)
3.
Ottenimento dei cloni (immunodosaggio finale) e mantenimento dei cloni
Fermentazione degli ibridomi
TERRENO HAT
H:
IPOXANTINA
A:
AMINOPTERINA
T:
TIMIDINA
Substrato enzima
HGPRT
Inibitore enzima
DHPR
Substrato enzima
TK
Attivazione
“via di salvataggio”
Blocco
“sintesi de novo”
Attivazione
“via di salvataggio”
IMP
TMP
AMP
Conclusioni:
1.
GMP
2.
L’Aminopterina blocca la sintesi de novo unica via attiva per la
sintesi del DNA nelle cellule di mieloma (HGPRT difettose)
che quindi non crescono;
Ipoxantina e Timidina rappresentano le fonti esterne delle via di
salvataggio per la sintesi del DNA consentendo la crescita
selettiva delle cellule di ibridoma.