WESTERN BLOT
VANTAGGI:
- le proteine sono più accessibili;
-non c’è perdita di risoluzione se il trasferimento delle proteine
viene eseguito correttamente;
-durata e stabilità delle membrane;
-una volta trasferite le proteine possono essere conservate per mesi;
- il western blot può essere analizzato diverse volte
WESTERN BLOT
La procedura può essere suddivisa in 3 passaggi:
1. separazione elettroforetica dei polipeptidi
2. trasferimento di tutte le proteine su una membrana appropriata
3. visualizzazione delle proteine di interesse
SEPARAZIONE DEI PEPTIDI
una miscela di proteine può essere risolta mediante svariate tecniche
elettroforetiche (gel non-denaturante, gel contenente SDS, gel per
isoelettrofocalizzazione…)
GEL DI POLIACRILAMIDE
• si ottiene dalla copolimerizzazione di acrilamide con N,N’metilenbisacrilamide in presenza di un catalizzatore e di un iniziatore
• la porosità del gel dipende dalla concentrazione di acrilamide e
bisacrilamide
• le proteine vengono separate sulla base delle loro dimensioni, in quanto
la presenza di SDS conferisce a tutte le molecole la stessa carica
CELLA PER ELETTROFORESI VERTICALE SU GEL
TRASFERIMENTO SU MEMBRANA
Per trasferire proteine dalla matrice del gel sono state utilizzate tre procedure
1. diffusione per contatto
2. capillarità o blotting per convezione
3. blotting elettroforetico
VISUALIZZAZIONE
GENERALE: si ottiene utilizzando coloranti quali Comassie Blue,
Ponceau Red, India ink, fast green e Aurodye
Ponceau e fast green sono i più facilmente lavabili,
quindi non interferiscono con eventuali detection
specifiche
SPECIFICA: si ottiene utilizzando sonde con isotopi radioattivi
o mediante anticorpi specifici
METODI USATI PER LA VISUALIZZAZIONE SPECIFICA