Elettroforesi
proteine ed acidi
nucleici
Flavia Frabetti
Tecnici di laboratorio
2010/2011
ELETTORFORESI
• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica
di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico
• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico
matrice di gel
cella elettroforetica
alimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante)
tamponi salini
si possono studiare sia gli
acidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine
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Matrice di gel
serve da “setaccio” molecolare e consente
la separazione
può essere fatto di polimeri
agarosio o poliacrilamide
Come si forma il gel?
Gel di agarosio:
pesare l’agarosio
misurare il buffer (TBE/TAE)
bollire l’agarosio in buffer
versare il gel nella vaschetta allestita
Gel di acrilamide:
miscelando acrilamide e bis-acrilamide che
formano un polimero complesso a maglia*
Gel di acrilamide
• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine
• di solito in sistemi verticali, poiché se ne fanno “lastre” di 0,2-0,4 mm
i cui pozzetti non sarebbero “caricabili” in un sistema orizzontale
• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende
principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del peptide
concentrazione di acrilamide
conformazione della molecola (denaturata o meno)
voltaggio
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Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE
PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteine
è di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide
tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistema
verticale
campione
SDS = detergente
pozzetti
(sodio-dodecil-solfato)
con i campioni
catodo
carico
tampone
-
well= pozzetto
lane= corsia
supporto
di
plastica
anodo
tampone
DENATURAZIONE DELLE PROTEINE: preparazione del
campione (sample) con proteine denaturate
bollitura
proteina tetramerica
proteina monomerica
bollitura
peptidi separati
peptidi connessi da
ponti disolfuro
SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico)
BME = β- mercaptoetanolo (riducente)
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Scelta della % di acrilamide in rapporto
alla taglia molecolare delle proteine
Acrilamide(%)
Intervallo di
separazione dei peptidi
(in kilodalton)
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200 - 25
10
100 - 15
12.5
70 - 10
pH
I fase:
basico
separazione
per
carica
15
60 - 6
20
40 - 4
II fase: separazione dimensionale
pH
acido
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
SU GEL o ISOELECTROFOCUSING
punto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica netta
di una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, qui
La proteina non sarà più soggetta a migrazione
elettroforetica
Dal Chieffi
riquadro 2.2 pag:44-48
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Rivelazione della separazione elettroforetica:
• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela
(es. con comassie blue o silver-stain)
• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici
di nitrocellulosa attraverso la tecnica del Western Blotting per
analisi più fini, specifiche
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate
con radioisotopi
2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate
con radioisotopi
consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare il
turn-over proteico (esperimenti di pulse-chaise)
l’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35S (emivita di 87gg)
metionina
cisteina
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2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
consente di riconoscere una specifica proteina di interesse
consta di diverse fasi schematizzabili in:
a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa
b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica)
a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa
carta imbevuta
di tampone
trasferimento
delle proteine
carta imbevuta
di tampone
proteina di interesse
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b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) fasi procedurali
la membrana viene saturata da
proteine inerti
anticorpi II
legano gli anticorpi I
anticorpi I
legano l’antigene
sviluppo della
colorazione
enzimatica
Verifica qualitativa e quantitativa
acidi nucleici
Spettrofotometro
Analisi a λ= 260 nm
Si misura la ssorbanza o
densità ottica O.D.
1 O.D. ≈ 50 µg DNA
1 O.D. ≈ 40 µg RNA
1 O.D. ≈ 30 µg oligonucleotidi
λ= 280 nm proteine
260/280 > 1,8 (≈2) è abbastanza puro
Nanodrop ®
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Gel di agarosio
• utili per la separazione e caratterizzazione di acidi nucleici
• di solito in sistemi orizzontali
• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel di agarosio
dipende principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del DNA o RNA
concentrazione di agarosio
conformazione della molecola
voltaggio
preparazione gel
Allestimento della tecnica
elettroforetica su gel orizzontali
di agarosio (schema)
caricamento campioni
(Ø 5mm/well)
Campione (sample)viene diluito in un
tampone di caricamento (loading
buffer) che contiene 2 coloranti per
tracciare la corsa:
connessione ed
accensione
Blu di bromofenolo (Bb) 300 bp
Xilene cianolo (Xc) 4.000 bp
rilevazione
ed anche glicerolo per appesantire il
campione
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Corsa e rilevazione su gel orizzontali
di agarosio - procedure
Riempire la vaschetta
con il buffer
Caricare i campioni sul gel
Accendere l’alimentatore
(parte la corsa del gel)
Analisi del gel al transilluminatore
Fine della corsa
Risultato
std molecolari o markers a dimensione nota
Le molecole più grandi hanno
V minore, per > attrito e perché
vengono intrappolate di più nelle
maglie del gel
Bande luminose per via del bromuro di etidio (intercalante del DNA)
che “fluoresce” ai raggi UV e si vede banda giallo-arancio
Limite di sensibilità 1-5 ng di DNA
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Taglia molecolare del DNA o RNA e migrazione
Agarosio (%)
Intervallo di separazione
di DNA lineare (in Kb)
0.3
60 - 5
0.6
20 - 1
0.7
10 - 0.8
0.9
7 - 0.5
1.2
6 - 0.4
1.5
4 - 0.2
2.0
3 - 0.1
Di norma si applica un voltaggio di 5 Volt /cm di lunghezza
della vaschetta
Il voltaggio (V) tende a variare durante la corsa in rapporto alla
variazione nella distribuzione delle cariche e del pH
Durante la corsa la resistenza (R) aumenta
V= i x R
per avere una migrazione costante deve aumentare anche V
Uniformità di calore e pH:
le corsie periferiche sono più fredde (effetto smile) di norma evitato
con tubicini che collegano parte negativa e positiva
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I gel di poliacrilamide per separare acidi nucleici sono usati se:
• si devono separare piccoli oligonucleotidi < 100 basi, si possono
risolvere anche oligo diversi anche per 1 nucleotide
• sono di solito a basse concentrazioni di acrilamide (<=6%)
e contengono Urea (6M)
Stima della dimensione di una molecola
in rapporto alla mobilità elettroforetica
di std di dimensione nota
(questo vale anche per le proteine)
Il DNA è una molecola che ha un
rapporto “carica/massa” costante
e dunque uniformità nella separazione
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Gel controllo DNA
markers
a dimensione
nota
pozzetti
frammenti
di
DNA
genomico
(50-100Kb)
La quantità di DNA attesa è di 7 pg per cellula umana diploide
Es. globuli bianchi 6.000/µl ovvero 6.000.000/ml
6.000.000 x 7 pg= 42.000.000 pg = 42.000 ng= 42 µg
GEL DNA APOPTOSI
ladder (scala) apoptotico
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Gel controllo RNA
28S (5000 basi)
18S (2000 basi)
5S+tRNA(100 basi)
L’80-85% di RNA cellulare e costituito da rRNA, circa il 10% da tRNA
E tra 1-5 % da decine di migliaia di mRNA diversi
Gel degradazione RNA,
contaminazione DNA
effetto SMEAR striscia
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