Elettroforesi su gel
L’elettroforesi è definita come la migrazione di
particelle sotto l’influenza di un campo elettrico.
La mobilità della particella dipende dalla forza
elettrostatica netta che agisce sulla particella.
Nell’elettroforesi su gel c’è un mezzo di supporto che
agisce impedendo disturbi meccanici e di convenzione
durante la migrazione e che serve da setaccio
molecolare per separare le molecole, provviste della
stessa carica, in base alle dimensioni.
La matrice può essere costituita da poliacrilammide,
agarosio o una miscela di questi.
I gel di agarosio sono largamente impiegati per
separare molecole di DNA di dimensioni maggiori di
100 bp, si ricorre ai gel di acrilammide quando serve
una risoluzione maggiore per frammenti di DNA di
piccole dimensioni.
L’agarosio è un polisaccaride lineare purificato
dall’agar-agar delle alghe rosse; è solubile in acqua
bollente e quando la soluzione si raffredda si forma
un gel a causa della formazione di legami idrogeno
tra le catene polimeriche dell’agarosio.
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Solitamente la preparazione di gel d’agarosio
richiede pochi minuti:
a) si pesa l’agarosio
b) si aggiunge l’adeguata quantità di tampone TAE
(Tris-acido acetico-EDTA)
c) si scioglie l’agarosio
d) si aggiunge bromuro d’etidio (colorante che si lega
al DNA intercalandosi tra le basi complementari e
mostra una forte fluorescenza quando illuminato
con luce UV) in concentrazione pari a 0.5-1mg/ml
e) si lascia solidificare il gel
f) il DNA viene addizionato di una soluzione tampone
contenente il 30% di glicerolo e, solitamente, blu di
bromofenolo e xilene cianolo
Il gel viene posto nella camera di corsa, si carica
il campione e si attende che il DNA migri verso il
polo positivo (i coloranti addizionati indicano
l’avanzamento del campione nel gel).
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In alcuni casi è necessario recuperare il DNA
dopo la corsa elettroforetica: il frammento di
DNA di interesse viene tagliato dal gel, posto su
un transilluminatore, con un bisturi e posto in
una microprovetta.
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La matrice di agarosio viene sciolta in un bagnetto
termostatato, la soluzione ottenuta viene caricata su
una resina.
Solo il DNA resta legato alla resina mentre il resto
(agarosio e sali) viene rimosso tramite tamponi di
lavaggio contenenti Sali e etanolo
Si lascia evaporare l’etanolo e si eluisce il DNA con
acqua.
L’elettroforesi può essere su gel verticale o orizzontale.
Elettroforesi su gel verticale: il gel viene formato tra due
lastre di vetro che sono mantenute verticali parallele e
separate da sottili spaziatori.
Un pettine di plastica viene sistemato nella soluzione
prima che polimerizzi in modo da costruire i pozzetti per il
caricamento del campione.
Preparata la matrice, questa viene posta nella vasca di
corsa che, inferiormente viene riempita di tampone.
Nella parte che sovrasta il gel si crea una nuova vasca
che viene anche essa riempita di soluzione tampone;
qui sono immersi gli elettrodi.
L’alimentatore fornisce corrente agli elettrodi, nella
soluzione tra gli elettrodi la corrente viene condotta dagli
ioni del tampone.
Le particelle caricate si muovono nel gel in funzione
della loro carica e massa molecolare.
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Un gel precast viene montato nel suo
alloggiamento
Il gel viene fissato nella cassetta
elettroforetica
La cassetta viene montata
nell’alloggiamento con gli elettrodi
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Il gel viene caricato con l’estratto
proteico
L’alloggiamento viene inserito nella
camera inferiore con il tampone
Si monta la camera superiore e si
applica la tensione elettrica
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Qualora si debbano separare delle proteine si può
condurre un elettroforesi denaturante o nativa.
Nell’elettroforesi denaturante i campioni proteici,
prima del caricamento su gel vengono trattati con un
tampone contenente β-mercaptoetanolo e SDS e
riscaldati a 100°C.
In questa situazione tutte le proteine, cariche
negativamente e denaturate, si spostano nel gel
solo in funzione del peso molecolare delle subunità
che le costituiscono.
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Nell’elettroforesi nativa, invece, i campioni non
vengono denaturati né caricati negativamente prima
della corsa: la velocità di migrazione pertanto sarà il
risultato della massa molecolare del campione e della
sua carica intrinseca.
Elettroforesi su gel orizzontale: (vedere
descrizione precedente: gel agarosio) il gel in
questo caso viene colato in una vaschetta
fornita di un pettine in modo da creare i pozzetti
di caricamento e fatto correre in orizzontale in
una
cella
elettroforetica
riempita
preventivamente di tampone di corsa.
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Attrezzature per elettroforesi
orizzontale su gel di agarosio
Un esempio di gel di agarosio colorato
con bromuro di etidio
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Gel di poliacrilammide (PAGE): i gel di acrilammide sono
preparati facendo polimerizzare monomeri di acrilammide in
presenza di piccole quantità di N,N’-metilenbisacrilammide.
La polimerizzazione inizia con l’aggiunta di ammonio
persolfato (APS) e TEMED.
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato:
si producono radicali liberi che attaccano i monomeri di
acrilammide e ne avviano la polimerizzazione.
I gel denaturanti contengono, inoltre, anche SDS, un
detergente anionico che denatura le proteine e gli
conferisce carica negativa.
La grandezza dei pori della matrice è determinata
dalla percentuale di acrilammide presente
Si dicono gel in gradiente quelli in cui la
concentrazione di acrilammide varia nella fase di
caricamento (più lassa) e in quella di separazione
(più concentrata).
Il vantaggio dei gel in gradiente è che la
separazione che si ottiene risulta migliore.
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Le proteine separate tramite SDS-PAGE, finita la corsa,
vengono fissate su gel (tramite soluzioni contenenti
metanolo) e poi evidenziate tramite un opportuno
metodo di colorazione.
Di solito si ricorre alla colorazione con l’argento (silver
stain) quando si richiede una maggiore sensibilità,
mentre si impiega blu di commassie quando la quantità
di proteina caricata è maggiore.
SDS-PAGE
acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%
Colorazione con Blu di Coomassie
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Argento: Si fissano le proteine con il metanolo, si
aggiunge nitrato di argento che si lega alle proteine. Si
aggiunge quindi formaldeide in bicarbonato per ridurre
l’Ag+ ad argento metallico. La reazione viene fermata
con acido acetico. Il procedimento e’ analogo a quello
dello sviluppo fotografico.
Blu Comassie: Per prima cosa si fissano le proteine al
gel con una soluzione di acido acetico e metanolo. Si
aggiunge il colorante in acido acetico e metanolo, si
lascia a reagire finche’ tutto il gel e’ diventato blu, poi si
decolora con acido acetico e metanolo
Se le bande proteiche sono marcate con isotopi radioattivi
possono essere rivelate tramite autoradiografia.
E’ possibile, ad esempio, produrre proteine che contengono
35S-metionina producendole in vivo in cellule cui viene
somministrato l’aminoacido marcato.
Le proteine radiomarcate, dopo separazione su gel,
vengono rivelate seccando il gel e mettendolo in diretto
contatto con una lastra da raggi X.
Western blot:
Le proteine separate in elettroforesi (SDS-PAGE)
possono essere trasferite su un foglio di nitrocellulosa.
Il trasferimento, di solito, si effettua per elettroblotting:
il gel e la nitrocellulosa vengono posti in un apposito
supporto a forma di sandwich, immerso in un tampone,
nel quale ci sono due elettrodi paralleli.
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La corrente trasferisce le proteine dal gel sul foglio di
nitrocellulosa.
Il foglio viene quindi saturato con siero di latte in polvere
privo di grassi al 10%, oppure con una soluzione salina
contenente una concentrazione opportuna di BSA, per
bloccare i legami aspecifici e, poi, sottoposto a reazione
con anticorpi.
Western Blotting
-
Buffer-soaked
filter papers
+
Nitrocellulose
membrane
Gel
Buffer
Electrode
SDS-PAGE
Direction of
transfer
Assemble ‘sandwich’
Wet blotting
Graphite Electrode Plates
-
Stained
(Red
Ponceau)
+
Semi-dry blotting
Nitrocellulose with bound proteins
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L’anticorpo primario è diretto contro la proteina di interesse; il
secondario è diretto contro le IgG dell’organismo usato per
produrre l’anticorpo primario.
Gli anticorpi secondari sono opportunamente marcati in modo
da poter essere rivelati una volta legato l’anticorpo primario
(in genere sono coniugati ad un enzima come ad esempio la
perossidasi).
Il blot viene quindi incubato con una soluzione contenente il
substrato dell’enzima che viene convertito in un prodotto
colorato.
Produzione di anticorpi
Gli anticorpi sono proteine prodotte dalle cellule B del sistema immunitario.
Consistono di due frammenti: il frammento Fc e il frammento Fab.
Il frammento Fc, in un dato animale, è sempre lo stesso in tutti gli anticorpi.
Il frammento Fab, invece, è variabile, riconosce e si lega ad un epitopo
dell’antigene.
Antigene: sostanza che scatena una risposta immunitaria.
Epitopo: regione dell’antigene a cui si lega un anticorpo.
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Anticorpi primari: si distinguono in policlonali e monoclonali.
Anticorpi policlonali: quando un antigene viene iniettato in un animale
(topo, coniglio, capra) viene prodotta una miscela di anticorpi.
Migliaia di parti diverse (epitopi) dell’antigene sono coinvolte nell’attivazione
di migliaia di cloni di cellule B, ciascuno producente un anticorpo diverso.
Questi anticorpi sono chiamati policlonali perché hanno specificità
diverse verso epitopi diversi.
Anticorpi monoclonali: gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici
diretti contro un epitopo specifico di una proteina.
Sono prodotti da un clone derivato da una singola cellula.
Per ottenere anticorpi monoclonali occorre:
-iniettare l’antigene in un topo
-prelevare la milza del topo dopo qualche settimana
-le cellule prelevate dalla milza vengono fuse in vitro con
cellule di mieloma (tumorali)
-ciascuno degli ibridi cellulari derivanti dalla fusione si
moltiplica
-analisi e selezione degli ibridomi
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Anticorpi secondari
Gli anticorpi primari, di solito, non sono marcati e quindi non rilevabili.
Si usano perciò degli anticorpi secondari marcati, diretti contro il
frammento Fc, che consentono di rilevare l’avvenuto legame
all’antigene e quindi la presenza dell’anticorpo primario.
Vantaggi uso anticorpi secondari:
1) Amplificazione del segnale, aumento sensibilità del saggio.
2) Il secondario può essere usato contro tutti gli anticorpi primari
prodotti nello stesso organismo (es. contro tutti i primari prodotti in
coniglio)
La presenza di bande colorate sulla nitrocellulosa
indica la presenza della proteina di interesse.
Un metodo alternativo e più sensibile sfrutta il
luminolo (un substrato chemiluminescente) la
perossidasi ossida il luminolo con produzione di luce,
la luce emessa può essere rivelata esponendo il blot
a una lastra fotografica.
Trasferimento degli acid nucleici su membrana
(blotting)
Blotting: trasferimento e immobilizzazione di un campione
di acidi nucleici su un supporto solido (in genere
nitrocellulosa o nylon).
Southern blotting
Il gel di agarosio contenente il DNA da trasferire
(precedentemente digerito con enzimi di restrizione) viene
posto su un ponte di carta da filtro, le cui estremità
pescano all’interno di un recipiente contenente il tampone
di trasferimento.
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La membrana viene posta in contatto con il gel e
coperta da una pila di tovaglioli di carta assorbente,
che, per capillarità, richiamerà il tampone.
Le molecole di DNA vengono trasportate dal flusso di
tampone attraverso il gel verso i tovaglioli di carta,
rimanendo intrappolate sulla membrana che non è
permeabile al DNA.
•Condizione essenziale è il pretrattamento del gel: il
DNA su gel viene trattato con una soluzione di HCl
0.25M e poi con una soluzione alcalina (depurinazione
e denaturazione), il gel viene poi posto in una soluzione
neutralizzante per riportare il pH a valori simili a quelli
del tampone di trasferimento.
•(la depurinazione è necessaria solo per frammenti di
DNA molto grandi; la depurinazione assicura che,
durante le denaturazione in NaOH, il DNA venga rotto a
livello delle basi depurinate)
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Dopo il trasferimento gli acidi nucleici devono essere
fissati sulla membrana: in genere si utilizzano i raggi UV
(inducono la formazione di legami covalenti tra le Timine
del DNA e i gruppi amminici carichi presenti sulla
membrana) o si pone la membrana in stufa a 80°C.
•Si procede, poi, con l’immersione della membrana in
una soluzione contenente RNA o DNA a singolo
filamento o oligonucleotidi marcati la cui sequenza sia
complementare a quella del frammento che si vuole
identificare sulla membrana.
•Le condizioni di ibridazione vengono scelte in modo da
massimizzare la quantità di sonda legata al bersaglio e
ridurre il legame non specifico.
•La membrana viene quindi lavata per eliminare
l’eccesso di sonda non legato. L’avvenuto legame viene
evidenziato mediante autoradiografia (ovvero mettendo
la membrana in contatto con una lastra da raggi X).
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Differenti condizioni di ibridazione producono
appaiamenti non corretti. Se si desidera ottenere solo
l’appaiamento alle sequenze target di DNA, la reazione
di ibridazione viene condotta appena qualche grado al
di sotto della temperatura di fusione della doppia elica
(melting temperature). Quando la sonda di DNA viene
usata per trovare DNA che sono correlati, ma non
identici, alla sequenza, l’ibridazione viene condotta a
temperature più basse. Ciò consente l’appaiamento
imperfetto e la formazione della doppia elica. Solo le
condizioni di ibridazione a bassa temperatura possono
essere usate per cercare geni (C e E nell’esempio) che
sono simili ma non identici al gene A
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In genere l’ibridazione viene effettuata in condizioni di
bassa stringenza, mentre i lavaggi hanno una
stringenza via via più elevata (temperatura maggiore o
salinità più bassa)
Gel electrophoresis
10_05_gel.electrophor.jpg
USI
• Identificare mutazioni, delezioni,
riarrangiamenti genici
• Usato in prognosi di tumori e in diagnosi
prenatale di malattie genetiche
• Leucemie
• Diagnosi di HIV-1 e malattie infettive
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USI
• Ogni individuo possiede sequenze ripetute
caratteristiche (chiamate Variable Number
Tandem Repeats, VNTRs)
• Per trovare queste sequenze VNTR si usa
il Southern.
Northern blotting:
La Tecnica Northern viene utilizzata per misurare quantitativamente
un determinato mRNA e valutare la dimensione di un mRNA.
Si segue all’incirca la procedura del Southern, ma in questo caso si
prepara un gel di agarosio denaturante (formaldeide, MOPS,…).
Si carica l’RNA denaturato (formaldeide e formammide) e si manda la
corsa. Si ottiene una strisciata nella regione dei mRNAs, infatti ho
mRNA di diversa lunghezza.
Per vedere l’mRNAdi interesse, si effettua un trasferimento su
nitrocellulosa o nylon, poi si fa ibridare una sonda radioattiva fatta con
il gene di interesse.
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