La Pulizia ad Ultrasuoni di Strumenti Speciali
Chris H. Miller, PhD (dottorato di ricerca)
Direttore del Progetto
Professore - Laboratorio per il Controllo delle Infezioni
Università dell’Indiana - Scuola di Odontoiatria
OBBIETTIVO
L’obbiettivo di questo studio è stato quello di misurare la pulizia ad ultrasuoni di 4 marchi di curettes dentali.
METODO
Queste procedure sono state selezionate in base a studi precedenti sulla
pulizia degli strumenti e sulla pulizia con apparati ad ultrasuoni (1) in apparecchiature per il lavaggio e la disinfezione (2). Comunque, in questo studio
la rimozione del sangue è stata misurata saggiando le proteine su strumenti
puliti e non puliti in aggiunta al saggio (1) Hemastix per il sangue. Le procedure per il recupero e la misurazione delle proteine sono state modificate
da uno studio precedente (3). Le proteine rimanenti sugli strumenti dopo la
pulizia saranno misurate quantitativamente usando il metodo Lowry (J Biol
Vhem 1951; 193:265) per le analisi delle proteine. Questo metodo rivela una
vasta tipologia di proteine e glicoproteine.
-----------------------------------------------(1) Miller, CH and Hardwick, LM: Ultrasonic cleaning of dental instruments in
cassettes. Gen Dent 1988; 35:31-36.
(2) Miller, CH, Tan, CM, Beiswanger, et al: Cleaning dental instruments: Measuring the effectiveness of an instrument washer/disinfector. Amer J Dent 1999;
13:39-43.
(3) Testing the cleaning effi cency in decontamination equipment. Part 1. Zentr
Steril 1997; 5:333-344.
-----------------------------------------------Sommario
Quattro marche di curettes dentali sono state contaminate con sangue di
pecora contenente hydroxyapatite a seguito di immersione completa nel
composto. Gli strumenti, dopo essere stati esposti alla temperatura ambiente per 1 ora, sono stati posizionati nel cestello per la pulizia ad ultrasuoni e lo
stesso è stato inserito nell'apparato per la pulizia ad ultrasuoni contenente
una soluzione specifica. Il macchinario è stato poi avviato con cicli di 90, 120
e 300 secondi. Durante ogni ciclo sono stati utilizzati 5 strumenti per ogni
marca per un totale di 20 strumenti. Per ogni intervallo di tempo sono stati
completati tre cicli. Per ogni ciclo si e fatto uso di una nuova soluzione per
la pulizia ad ultrasuoni. Gli strumenti sono stati sciacquati in modo standardizzato ed analizzati visivamente per la presenza di contaminanti residui,
saggiati con il metodo Hemastix per il sangue e quantitativamente per le
proteine. Gli strumenti di controllo venivano contaminati e, senza essere
puliti, analizzati per il contenuto di proteine.
stati identificati come A,B,C e D rispettivamente. Tutti gli strumenti sono
stati accuratamente puliti prima di essere usati e riusati durante lo studio.
Contaminazione degli Strumenti con Sangue e Hydroxyapatite
Sia le curettes “test” sia quelle “controllo” sono state contaminate con una
mistura di sangue e hydroxyapatite (HA). L’HA insolubile ha simulato la
struttura del dente. È stato utilizzato uno stesso lotto di sangue di pecora
defibrinizzato. HA è stata aggiunta al sangue a 50 mg per mL e mescolato
prima di ogni uso.
Contaminazione totale degli strumenti
La mistura di sangue e HA è stata inserita in una bacinella sterile e ogni
strumento test e controllo è stato sommerso completamente nella
stessa per 10 secondi. Ogni strumento è stato poi rimosso dal sangue
e tenuto in verticale per 10 secondi perchè si asciugasse gocciolando. Tutti gli strumenti contaminati sono stati messi ad asciugare per
un’ora a temperatura ambiente, su una rastrelliera coperta con contatto minimo con le superfici contaminate, prima di essere messi in una
vaschetta per gli strumenti per la pulizia (test) o prima di essere direttamente analizzati per le proteine del sangue senza pulizia (controlli).
Trattamento degli Strumenti “Test” con la Pulitrice ad Ultrasuoni
Ognuno dei tre cicli nella pulitrice ad ultrasuoni è stata eseguita con un cestello contenente 5 strumenti ”test” di ciascuno dei 4 marchi contaminati ed
essiccati. Gli strumenti sono stati posizionati in un’unico strato (Fotografia 2).
Per ogni ciclo si e fatto uso di soluzione per la pulizia ad ultrasuoni fresca. La
pulitrice ad ultrasuoni è stato messa in funzione per 90, 120 o 300 secondi.
Fig. 2 - Posizionamento degli strumenti nel cestello della pulitrice ad ultrasuoni.
Fig. 1 - Strumenti utilizzati per il test.
A
B
C
D
Materiali
È stata utilizzata una pulitrice ad ultrasuoni L&R (Quantrex S310) con una
vaschetta inossidabile insieme ad una soluzione per la pulizia ad ultrasuoni
Health Sonics All-purpose Cleaning Solution diluita con 40 parti di acqua
corrente come indicato sull’etichetta del prodotto.
Il sangue di pecora defibrinizzato è stato ottenuto dalla Colorado Serum Co.
Denver, CO. Lo stesso è stato mescolato con l’hidroxyapatite a 50 mg/mL
della Sigma Chemical, St.Louis, MO. Per rimuovere il sangue rimanente sugli
strumenti venivano usati spazzolini per la profilassi (#201). Quanto sopra è
stato fornito dall’ Università dell’Indiana. Lo Sponsor ha fornito 10 curettes
per ciascuna marca American Eagle (Codice A), Dentsply (Codice B), Hu-Friedy (Codice C) e Lascod (Codice D) (Fotografia 1). Nelle tavole questi sono
Il Risciacquo degli Strumenti ”Test”
Il risciacquo sotto il rubinetto è un’operazione diffi cile da eseguire in maniera standardizzata e può inficiare i risultati del saggio sul sangue/proteine.
Dunque gli strumenti ”test” dopo il trattamento di contaminazione sono
stati sciacquati con una procedura standardizzata rimuovendo con cura il
cestello per la pulizia dalla camera di pulizia lasciandola essiccare su fogli
di carta assorbente per 10 secondi. Il cestello è stato poi immerso per due
volte in ciascuna di 4 distinti volumi di 2 litri d’ acqua corrente nuova a
temperatura ambiente. Gli strumenti ”test” dopo il risciacquo sono stati poi
analizzati per la presenza di sangue e proteine come descritto di seguito.
Trattamento degli Strumenti “Controllo”
Come strumenti ”controllo” sono stati utilizzati due set di cinque strumenti
per ogni marca. Gli strumenti ”controllo” sono stati contaminati con il sangue-HA e asciugati come fatto per gli strumenti ”test”, ma non sono stati
messi nella pulitrice ad ultrasuoni. Questi strumenti ”controllo” sono stati
analizzati con le stesse procedure utilizzate per il test e usati per calcolare la
percentuale di rimozione delle proteine.
Analisi per il sangue visibile
Ogni strumento è stato osservato ad occhio nudo per la presenza di sangue.
Questi dati sono stati presentati come il numero degli strumenti con
sangue visibile rispetto al numero totale degli strumenti analizzati.
Raccolta del materiale sugli strumenti
Tutte le superfici di ogni strumento test e controllo sono state spazzolate una ad una con uno spazzolino da profilassi #201 nuovo, tenuto con
una pinza emostatica, effettuando 40 colpi (spazzolate) verticali alternati in 5.0 mL di soluzione all'1% di sodio dodecil solfato (SDS) (uguale
al sodio lauril solfato) contenuto nella metà inferiore di una capsula di
Petri (3). L'SDS è utilizzato per contribuire alla dissoluzione delle proteine
rimanenti sugli strumenti e non interferisce con il saggio del sangue e
delle proteine. I 5.0 mL di SDS contenente il fluido di recupero da ogni
capsula di Petri è stato trasferito in una provetta pulita e lo spazzolino
da profilassi veniva inserito nella provetta e la provetta veniva agitata.
Saggio Hemastix per il sangue nel fluido di recupero SDS
La presenza di sangue nel fluido di recupero SDS è stato misurato quantitativamente usando l’ Hemastix. Si tratta di un striscia di plastic ricoperta da un
soluzione chimica che cambia colore quando esposta (immersa nel SDS) per
rilevare fino a circa 1ppm di sangue (1). L’intensità del colore sulla striscia e
visivamente comparata con una scala colori che indica l’ammontare relativo
di sangue presente come Nullo, Traccia, Piccola, Moderata o Grande. Per aggiungere un aspetto quantitativo a questa analisi, sono stati assegnati valori
numerici ad ognuno delle visualizzazioni come segue: Traccia=1; Piccola=2;
Moderata=3; Grande=4. Il numero degli strumenti risultati positivi al sangue sul numero totale degli strumenti e stato presentato insieme a i valori
numerici medi per ciascuno dei gruppi di 15 strumenti (5 strumenti in 3 cicli).
Analisi per la presenza di proteine del sangue nel fluido di recupero SDS
Il fluido di recupero SDS e stato quantitativamente saggiato per la presenza
di proteine usando il metodo Lowry descritto di seguito. Questi dati sono
stati presentati con tre modalità: 1) il numero di strumenti contenenti una
qualsiasi quantità di proteine rispetto al numero totale di strumenti analizzati; 2) come microgrammi di proteina per mL; 3) la quantità media recuperata da ogni gruppo di 15 strumenti (5 strumenti in 3 cicli) è paragonata
alla quantità media di proteine recuperata dagli strumenti di controllo non
puliti. Quindi veniva calcolata la % di rimozione di proteine dagli strumenti
test. Questo metodo Lowry è capace di identificare quantità così piccole
fino a circa 30 µg (un ammontare invisibile) di proteine per strumento. L’albumina di siero bovino (Frazione V, #A-4503, Sigma Chemical, St.Louis, MO)
verrà utilizzata come proteina per standardizzare il saggio di ogni lotto di
campioni analizzati.
calcolare la percentuale di rimozione delle proteine dagli strumenti “test”.
La Tavola 2 presenta i risultati del trattamento degli strumenti “test”
per mezzo della pulitrice ad ultrasuoni con vari tempi di pulizia.
Sangue visibile
La misura della pulizia degli strumenti nello studio dentistico consiste nell’assenza visiva di residui. In questo studio l’assenza visiva di sangue su tutti
gli strumenti in tutti i gruppi è stata raggiunta solo dopo 300 secondi di
pulizia ad ultrasuoni.
Saggio Hemastix per il sangue
L’analisi Hemastix è molto sensibile è può individuare sangue che non è
visibile ad occhio nudo. Questo saggio ha individuato quantità variabili di
sangue su tutti gli strumenti in tutti gli intervalli di tempo ad eccezione
degli strumenti D a 300 secondi dove ci sono stato 5 dei 15 strumenti liberi di sangue individuabile. La quantità relativa di sangue presente sugli
strumenti risultati positivi è stata presentata. Lo strumento di marca D ha
avuto il più basso livello di sangue individuabile, e questa differenza è stata
statisticamente significativa in tutti e tre intervalli di tempo.
Proteine
La marca D ha mostrato il numero minore di strumenti contenenti proteine
individuabili a 90, 120 e 300 secondi. La quantità media di proteine individuate in ciascuno dei 4 gruppi è stato il più basso nel caso dello strumento
D a 60 secondi e a 300 secondi. A 120 secondi la più bassa quantità media è
stata recuperata dallo strumento B. Tutti gli strumenti hanno mostrato una
rimozione delle proteine oltre il 99% in tutti i tempi di pulizia se comparati
con gli strumenti di controlli non puliti.
Table 1. Controls
Instrument
Protein Present (μg/mL)*
A
B
C
D
3151.00 ± 279.94**
3346.00 ± 458.80**
3276.00 ± 408.77**
3070.00 ± 440.83**
* values from 10 instruments – mean ± standard deviation
** values were not statistically different (p>0.05) as determined by
one-way analysis of variance (ANOVA)
Metodo Lowry per l’individuazione di proteine (J Biol Chem 1951; 193:265)
1. 0.6mL di campione
Table 2: Remaining contaminants after processinga
2. aggiunta di 3.0 mL di reagente E e mescolare
3. far riposare 10 minuti a temperatura ambiente
Cleaning
Visible
Hemastix
Hemastix
Protein
Protein
Instrument
4. aggiungere 0.3 mL di reagente F con mescolamentime (sec)
bloodb
positivesb
valuesc
positivesb
valuesd
to rapido e immediato
A
90
2/15
15/15
3.3
13/15
15.53 ± 8.95
5. far riposare 30 minuti a temperatura ambiente
6. leggere l’assorbimento a 690 nm usando uno
B
90
2/15
15/15
3.0
13/15
16.00 ± 9.89
spettrofotometro
C
90
0/15
15/15
3.3
13/15 16.33 ± 10.30
Quantità conosciute della frazione V di albumina di
D
90
0/15
15/15
1.3*
6/15
4.93 ± 3.62
siero bovino verranno utilizzate come riferimento nel
saggio al fine di calcolare il numero di µg di proteiA
120
1/15
15/15
3.1
5/15
8.40 ± 14.88
ne presenti nei campioni di fluido di recupero SDS.
L’ SDS non interferisce con questa analisi.
B
120
3/15
15/15
3.3
6/15
4.80 ± 6.36
Reagent A: 2.0% Na2CO3 in 0.1NaaOH
Reagent B: 0.5% CUSO4 - 5H20 in acqua deionizzata
C
120
5/15
15/15
3.5
10/15 14.80 ± 16.44
Reagent C: 1.0% tartrato di sodio - potassio in acqua
D
120
2/15
15/15
2.3*
2/15
4.93 ± 3.62
deionizzata
Reagent D: volumi uguale di Reagenti B e C
A
300
0/15
15/15
2.3
3/15
2.93 ± 6.36
Reagent E: 50.0 mL e Reagente A piu 1.0 mL di Reagente D (preparare fresco giornalmente)
B
300
0/15
15/15
2.7
6/15
4.93 ± 6.88
Reagent F: Reagente fenolo (reagente Folin-CiocalC
300
0/15
15/15
2.7
7/15
7.13 ± 7.40
teau) a 1.0 N
RISULTATI
La Tavola 1 presenta i risultati del recupero delle proteine da i quattro tipi di strumenti che erano stati contaminati ma non puliti “controlli”. La quantità media
di proteine del sangue recuperata da i quattro tipi di
strumenti di controllo non puliti non e stata significativamente differente. Questi dati sono stati usati per
D
300
0/15
10/15
0.9*
2/15
% protein
removede
1.73 ± 4.71
99.51
99.52
99.50
99.84
99.73
99.86
99.55
99.84
99.91
99.85
99.78
99.94
a Results based on three runs of five instruments
b Number positive over total number of instruments
c Qualitative readings of Trace, Small, Moderate and Large were converted to numerical values and the average presented
(Trace = 1; Small = 2; Moderate = 3; Large = 4)
d Average protein detected from all 15 instruments ± standard deviation
e Based on the amount of protein present on control instruments (average: n = 15)
* The difference of this value from the other three values at each time period is statistically significant (p = 0.001)