PROTEOMA E PROTEOMICA
Le proteine hanno due valori intrinseci che ne determinano le
caratteristiche specifiche:
1. Punto isoelettrico (pI)
2. Peso molecolare (Mw)
PRINCIPIO DELL’ELETTROFORESI
BIDIMENSIONALE
+ve (anodo)
pH 3.0
IEF
-ve (catodo)
pH 10.0
Carica
Grande
SDS-PAGE
Peso molecolare
Piccolo
+ve (anodo)
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO
Una efficace procedura di preparazione del campione deve includere
¾
¾
¾
¾
¾
Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche,
incluse quelle idrofobiche
Prevenzione dell’aggregazione proteica e mantenimento della
solubilità durante IEF
Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al
processo di estrazione
La rimozione di macromolecole che possono interferire
Una resa proteica adeguata per la valutazione che potrebbe
implicare la rimozione di specie proteiche molto abbondanti
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO
Le proteine devono essere denaturate e solubili
Questo processo si ottiene tramite trattamenti specifici con:
¾ Urea (denaturante)
¾ Tioli (riducenti)
¾ Detergenti
¾ Inibitori di proteasi
UREA
L’urea è l’agente caotropico più utilizzato, ma in casi
specifici con problemi di solubilizzazione si può utilizzare
la tiourea. Entrambi questi agenti rompono i ponti
idrogeno intra e inter –molecolari.
Normalmente si utilizza urea 8M, ma anche miscele di
tiourea 2M e urea 5-8M.
DETERGENTI
I detergenti vengono aggiunti per rompere interazioni
idrofobiche e incrementare la solubilità proteica al relativo
punto isolelettrico. I detergenti devono essere non ionici o
zwitterionici, quindi SDS non può essere utilizzato.
Vengono utilizzati CHAPS, CHAPSO o octilglucoside 1-2%
AGENTI RIDUCENTI
Per rompere i ponti disolfuro si utilizzano o ditiotreitolo
(DTT) o tributil-fosfina (TBP).
Una soluzione di DTT 50mM è sufficiente per la maggior
parte delle proteine, ma per casi difficili è consigliato
l’uso di TBP
ANFOLITI CARRIER
Le proteine tendono a
precipitare quando vicine al
loro pI, soprattutto in
assenza di sali, che in IEF
interferirebbero
con
la
focalizzazione. La mancanza
di sali può essere sopperita
dall’aggiunta
di
anfoliti
solubili al campione.
COMPOSTI CHE INTERFERISCONO
Acidi nucleici
Lipidi
Polisaccaridi
Sali
Proteasi
Ove è possibile è preferibile
eseguire un frazionamento del
campione
PREFRAZIONAMENTO
¾Estrazione differenziale
¾Frazionamento subcellulare
¾Cromatografia
¾IEF preparativa
ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE
PRIMA DIMENSIONE
Focalizzazione isoelettrica
Focalizzazione isoelettrica
MIGRAZIONE DELLE PROTEINE IN IEF
STRISCE PER IEF (isoelectrofocusing)
Utilizzano gradienti immobilizzati
Possono avere diverse lunghezze
Devono essere reidratate e corse in ambiente oleoso
Il gradiente di pH viene creato con set di tamponi
derivati dall’acrilammide.
La struttura generica è
CH2=CH-CO-NH-R
R= -COOH oppure –N(CH3)2
CORSA ELETTROFORETICA
Fino a 4 mg di proteine totali per strip
Il campione viene comunemente pre-adsorbito sulle strip
durante la loro reidratazione, permettendo anche alle
HMW proteins di entrare nel gel. Questo processo dura
almeno 11 ore, dopodichè si può passare alla focalizzazione
Durante la corsa elettroforetica la conduttività del gel
cambia dipendentemente dal numero di specie cariche,
diminuendo mano a mano che le varie specie si focalizzano
ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE
SECONDA DIMENSIONE
SDS-PAGE
SECONDA DIMENSIONE
La transizione dalla prima alla seconda dimensione
coinvolge l’equilibrazione della striscia focalizzata in
tampone contenente SDS, la deposizione di essa sul
gel di corsa e l’inglobamento in un gel di agarosio.
Agarose
SDS-PAGE
E’ esattamente uguale all’SDS-PAGE monodimensionale. Per avere un quadro generale si
utilizza solitamente un gradiente (es. 8-16%). Una
volta individuato il PM della regione di interesse, si
passa a gel a percentuale uniforme che mostra una
maggiore definizione.
Nel caso si debbano paragonare due campioni è
opportuno utilizzare due gel identici con corsa
parallela.
COLORAZIONE DELLE PROTEINE
Una volta separato il campione in elettroforesi è
possibile continuare con un Western blot, nel caso si
cerchi qualcosa di specifico, come modificazioni
proteiche
post-traduzionali.
Normalmente
si
procede alla colorazione del gel.
CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?
¾La scelta della colorazione dipenderà soprattutto
dalla quantità di proteine caricate.
¾Le colorazioni non devono interferire con i
processi successivi e, in ordine di sensibilità, sono le
seguenti:
¾Blu Coomassie
¾Argento
¾Coloranti fluorescenti
CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?
¾I gel sono o preparativi o analitici. Se lo scopo del
gel è quello di identificare proteine poco
abbondanti, si eseguirà un grosso caricamento con
una colorazione finale molto sensibile
¾Se la procedura viene utilizzata per ottenere un
antigene, le proteine non devono essere fissate al
gel, quindi la colorazione con argento verrà esclusa
¾In ogni caso ogni colorazione ha le proprie
limitazioni
CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?
La sensibilità raggiungibile con la colorazione è
determinata
¾ dalla quantità di colorante che si lega alla
proteina
¾dalla differenza di colorazione tra il campione e il
background del gel (signal-to-noise-ratio)
¾Ogni colorazione interagisce diversamente con le
proteine e non esiste una colorazione che sia in
grado di colorare tutte le proteine allo stesso modo.
Sembra però che tutti i coloranti interagiscano
meglio con aminoacidi basici
CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?
Premettendo che sia meglio effettuare colorazioni
diverse dello stesso campione, il colorante che
sembra riuscire a dare il più ampio spettro di
colorazione è il Blu Coomassie colloidale.
E’ possibile effettuare colorazioni successive dello
stesso gel (fluorescente, Coomassie e infine
argento)
CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?
Sypro Ruby
Silver staining
2D ELETTROFORESI DELLE PROTEINE DI C. elegans
3
kDa
43
30
20
14
pI
10
COLLEGAMENTO A BANCHE DATI
COMPARAZIONE CON 2D IN BANCA DATI
ANALISI DIFFERENZIALE
General detection methods
Coomassie Blue Dyes
- commonly used
- does not interfere with subsequent protein identification
- inexpensive
- sensitivity well below silver and fluorescent dyes
Silver stain
- sensitivity 10-50 times greater than CB
- ability to detect 1 ng of protein
- silver diammine/silver nitrate
- relatively expensive (reagents/waste disposal)
- high background
Fluorescent Stains and Dyes
- accurately determine changes in protein expression
- greater sensitivity than silver stain
- DIGE
- cost
Dual Channel Imaging Technique (DIGE)
1) Proteins are extracted from the cells or
tissues of interest.
2) The protein extracts are labeled with
different fluorescent dyes:
Extract 1
Extract 2
Cy5 dye
Cy3 dye
mix
3) The 2 extracts are mixed and then resolved
by 2-D gel electrophoresis.
Fluorescence staining
H2N-
CyDye DIGE containing NHS ester active group covalently
binds to the lysine residue of a protein via an amide linkage.
The DIGE technology platform
E-Cy5
E-Cy3
Excise spots; elute;
digest, extract peptides;
MS analyze, Protein
identification
Identification of differently expressed proteins by
Dual Channel Imaging Technique (DIGE)
Dual Channel Imaging Technique
SDS PAGE
IEF (pH 4-7)
PSHA_1_2360
PSHA_1_0849
PSHA_1_0021
PSHA_1_0871
PSHA_1_0658
PSHA_1_1875
PSHA_2_0363
PSHA_2_0420
PSHA_2_0259
PSHA_1_2262
PSHA_1_0255
PSHA_2_0474
PSHA_1_0328
PSHA_1_0416
PSHA_1_3009
PSHA_1_0119
PSHA_1_0595
PSHA_1_1740
PSHA_2_0557
PSHA_1_0870
PSHA_1_2758
PSHA_1_0689
PSHA_2_0370
PSHA _2_0370
PSHA_1_1059
PSHA_1_2400
PSHA_1_3038
PSHA_1_3001
PSHA_2_0144
PSHA_1_0341
PSHA_1_2145
PSHA_2_0150
Green label Proteome A; Red label = Proteome B
PSHA_1_2771
PROTEOMA E PROTEOMICA
"The analysis of the entire PROTEin content expressed by a genOME, or
by a cell or tissue type.“ Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995)
“PROTEOMICS is the
systematic analysis and
documentation of
proteins in biological
samples with focus on
state-related
expression of proteins.”
PROTEOMA E PROTEOMICA
L’approccio genomico non considera le possibili
modificazioni post-traduzionali
che tutte le proteine degli organismi superiori posseggono
APPROCCIO PROTEOMICO
Ricerca proteine in un lisato cellulare o in estratto tissutale la cui
espressione differenziale è determinata da fattori come
1.
2.
3.
4.
5.
Processi patologici
Delezioni o over-espressioni geniche
Trattamenti farmacologici
Stimolazioni chimiche e fisiche
Rimozione di nutrienti o di ossigeno
SCOPO DELL’APPROCCIO PROTEOMICO
¾Valutazione di marcatori diagnostici in fluidi corporei
¾Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione
di nuovi target proteici per trattamenti farmacologici e
“drug profiling”
¾Studi di tossicità
¾Glicosilazioni, fosforilazioni o processamenti proteici
¾Analisi tissutali in situazioni patologiche
TECNOLOGIA LEGATA ALLA PROTEOMICA
¾Elettroforesi bidimensionale
¾Rilevazione degli “spot” proteici
¾Analisi di immagine
¾Excisione degli “spot” proteici
¾Digestione enzimatica
¾Spettrometria di massa
¾Bioinformatica
ANALISI DEL GEL
L’acquisizione dell’immagine dipende dal sistema di colorazione
Per colorazioni in luce diretta si possono utilizzare
¾Densitometro
¾Telecamera
Per colorazioni in fluorescenza o radioattive
¾Scanner a fluorescenza
¾Phosphoimager
¾Telecamera su transilluminatore
COME IDENTIFICARE NUOVI SPOT?
Classica degradazione di Edman
Rimozione chimica di un residuo aminoacidico alla volta
e analisi dello stesso. Metodo lento che necessita di
grosse quantità proteiche
Spettrometria di massa
“Fingerprint” proteico e sequenza ex novo.
Metodo veloce che necessita di piccole quantità
proteiche
SPETTROMETRIA DI MASSA
E’ una metodica che
¾Misura accuratamente la massa proteica
¾Attraverso sequenze peptidiche
identifica proteine note e sequenzia
proteine ignote
¾Identifica modificazioni posttraduzionali
EXCISIONE DEGLI SPOT PROTEICI
DIGESTIONE PROTEICA
Excisione
dello spot
da gel
Digestione con proteasi
(tripsina) per una notte
Recupero del
surnatante e
estrazione dei
peptidi da gel con
acetonitrile
Evaporazione del solvente
e risospensione in
opportuna matrice
PEPTIDE MASS FINGERPRINT
La tripsina digerisce la sequenza proteica dopo un residuo di lisina (K) e
di arginina (R). Il peptide
YAEKGLQQPVRAYMESEKSEEIDLPK
verrà quindi digerito in corrispondenza delle frecce
I 4 peptidi derivati hanno una massa ben definita:
YAEK
GLQQPVR
AYMESEK
SEEIDLPK
609.31
797.45
857.38
957.54
Queste 4 masse definiscono esattamente il peptide della
sequenza precedente
COME RILEVARE I PEPTIDI?
Dopo la digestione il campione deve essere ionizzato tramite:
¾Protonazione:
M + H+ = MH+
¾Cationizzazione:
M + Cat+ = MCat+
¾Deprotonazione:
MH = M- + H+
¾Rilascio di elettroni:
M = M+ + e-
¾Cattura di elettroni:
M + e - = M-
COME RILEVARE I PEPTIDI?
Dopo la ionizzazione il campione viene fatto “volare” in
condizioni opportune.
Applicando lo stesso impulso a tutti i peptidi ionizzati, questi
percorreranno uno stesso tratto con un tempo relativo alla
loro massa. Questo tempo viene definito “tempo di volo”
(Tof)
SPETTROMETRIA DI MASSA
generazione di ioni in fase gassosa:
EI - Electron impact Ionisation (1919 A.J. Dempster)
CI - Chemical Ionisation
FAB
- Fast Atom Bombardment (1981 M. Barber)
MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
(1988, K. Tanaka et al.)
ESI
- ElectroSpray Ionisation (1985 J. Fenn)
SPETTROMETRIA DI MASSA
EI - Electron impact Ionisation
E’ la modalita’ piu’ classica.
E’ una ionizzazione ‘hard’.
Il campione deve essere in
stato di vapore.
Adatto per composti piccoli
(< 800 Da), volatili,
termicamente stabili.
Interfaccia con GC, anche
HPLC.
SPETTROMETRIA DI MASSA
FAB
- Fast Atom Bombardment
Il campione viene prima
dissolto in una matrice liquida
(es. glicerolo).
La superficie liquida viene
bombardata da un fascio di
atomi ad alta energia cinetica
(xenon o argon).
Le molecole di campione
vengono cosi’ ‘spruzzate’ via
dalla superficie, entrano nella
fase gassosa, e vengono
ionizzate, per protonazione o
deprotonazione.
L’introduzione di questa tecnica nei primi anni ‘80 ha rivoluzionato la
spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina.
Adatto ad es. per peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri (fino a ≈ 5000).
Ionizzazione ‘soft’. Quantita’ minima circa 20 picomoli.
SPETTROMETRIA DI MASSA
MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
Matrice cristallina
(anziche’ liquida).
Fascio di fotoni
(anziche’ di atomi).
Adatto per composti
simili a quelli
analizzabili con FAB, ma
a piu’ alta sensibilita’
(100-1000 volte meglio)
e con molti meno limiti
nelle dimensioni
dell’analita: pesi
molecolari fino a 300
kD.
SPETTROMETRIA DI MASSA
ESI
ElectroSpray Ionisation
Il potenziale applicato
alla fine dell’ ago e’
sufficientemente alto da
nebulizzare la soluzione
in una miriade di
goccioline cariche,
contenenti il campione.
ESI ElectroSpray Ionisation
Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla superficie
della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale →
esplosione ‘coulombica’ . Si formano ioni dell’ analita privi di solvente.
Le cariche sono statisticamente distribuite tra i siti
disponibili
dell’analita, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple.
La tecnica ESI e’ adatta per composti simili a quelli sottoponibili a MALDI, con
sensibilita’ ed estensione di dimensioni molecolari un po’ minori.
ESI si adatta all’interfacciamento con HPLC e elettroforesi capillare
SPETTROMETRIA DI MASSA
748.404
920.415
1271.61
1378.78
1484.97
1502.62
1562.8
1606.82
1815.83
1853.89
1884.95
1981.97
748.404
920.415
1271.61
1378.78
1484.97
1502.62
1562.8
1606.82
1815.83
1853.89
1884.95
1981.97
Nominal Mass
change (Da)
-42
-30
-18
-2
-1
1
14
16
28
32
35 & 37
42
44
56
64 + isotopes
74
78 & 80
80
126
132
176
210
226
229
454
541
617
784
Common Modifications and Residues
ornithine replaces Arg
homoserine replaces Met
loss of water, (crosslink, dehydration, pyroGlu, replaces Glu)
disulfide formation, dehydroalanine replaces Ala
amide group replaces acid
acid group replaces amide, citrulline replaces Arg
methylene group (methylation, homolog, etc)
oxygen atom (hydroxylation, Met sulfoxide formation, etc.)
formyl, 2 methyl groups, ethyl
addition of 2 oxygen atoms (dihydroxyl addition)
chlorine atom
acetyl, trimethyl group
carboxyl addition
t-butyl
selenocysteine replaces serine
glyceryl group
bromine atom
phosphoryl, sulfonyl groups
Modificazioni post-trasduzionali
iodine atom
pentosyl
proteine
glucuronosyl
myristoyl
biotinyl
pyridoxyl
coenzyme A
ADP-ribosyl
heme
FAD
di
TECNICHE MS E POTENZIALITA’
MALDI-Tof