Università degli Studi di Perugia
Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie
Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi
Proteomica e Metabolomica
Tecniche avanzate per l’analisi quantitativa del
proteoma
Pier Luigi Orvietani
A.A. 2011-2012
Limitazione elettroforesi bidimensionale (2DE)
Proteine altamente idrofobiche (Membrana)
Riproducibilità del dato sperimentale
Proteine ad alto peso molecolare
Range dinamico
Proteine basiche
Spettrometria di massa
Differential in gel electrophoresis
(DIGE)
ICAT
Isotope-Coded
Affinity Tagging
iTRAQ
Isotope Tagging for
Relative and
Absolute protein
Quantitation
Differential in gel electrophoresis (DIGE)
• Messa a punto nel 1997 (Unlü M, et al.,
Electrophoresis. 1997 Oct;18(11):2071-7. )
• Supera alcune limitazioni della 2DE classica
 Aumento del range dinamico
 Aumento della sensibilità (femtomoli)
• Riduzione della variabilità tecnica
(intracampione)
 Possibilità di individuare differenze di
espressione di ±15%
pH 4
pH 7
Differential in gel electrophoresis (DIGE)
La tecnica inizialmente prevedeva la marcatura delle
proteine con due fluorofori differenti Cy3, Cy5 (legame
covalente).
I differenti campioni vengono mixati prima della 2DE e
corrono contemporaneamente in un solo gel (< variabilità
intergel).
Le proteine presenti nei diversi campioni vengono rivelate
tramite differenti scansioni a specifiche lunghezze d’onda (λ)
con specifici apparati
Tramite opportuni software le immagini vengono
sovrapposte e dal differente grado di fluorescenza le
proteine vengono quantificate.
Tipologie di fluorofori
I fluorofori utilizzati nel DIGE per marcare i campioni sono gli stessi utilizzati
nelle tecniche di analisi dell’espressione genica (microarray).
Cy5
5
Cy3
• Sono fluorofori solubili in acqua della famiglia delle cianine
• Cy3 ha una λ di eccitazione massima a 550 nm ed emette a 570 nm
• Cy5 ha una λ di eccitazione massima a 649 nm ed emette a 670 nm
• Possiedono un gruppo funzionale R che permette il legame alla molecola di interesse
• Il legame del fluoroforo avviene in ambiente basico (importante il TRIS 40mM) tramite la reazione del
gruppo estere della N-idrossisuccinimmide con il gruppo amminico in epsilon dei residui di lisina delle
proteine del campione (1-3% delle lisine)
• Non viene alterato visibilmente nella 2D né il pI né il peso molecolare
Marcatura minimale
•Solamente il 3% delle proteine viene marcato (50 ug reagiscono con 400pM di dye)
• La lisina è uno degli Aa più abbondanti in natura, marcando tutte le proteine presenti nel
campione esse diverrebbero troppo idrofobiche
• Eventuali marcature multiple non vengono visualizzate perchè sotto il limite di detezione
(LOD) della tecnica
•Nessuna distorsione nel pattern 2D
Marcatura a saturazione
•È utilizzata nel caso di campioni con scarsa quantità di proteine
• La reazione avviene tra il gruppo maleimidico del fluoroforo e il gruppo tiolico
delle cisteine presenti nel campione (sono marcate tutte, elevato rapporto
Dye/campione)
Elettroforesi Bidimensionale
•Dopo la marcatura le proteine vengono
normalmente separate mediante elettroforesi
bidimensionale
• La digitalizzazione dei gel invece si avvale di
opportuni apparati
Standard interno
Per aumentare la riproducibilità e la precisione
della quantificazione è stato introdotto uno
standard interno, composto da uguali quantità di
proteine dei due campioni, ed è marcato
diversamente.
I vantaggi dello standard interno:
Possibilità di identificare con sicurezza le
variazioni di espressione delle proteine da
eventuali errori sperimentali.
Possibilità di “normalizzare” gli standard interni
con conseguente riduzione del numero di
ripetizione di corse.
Vantaggi DIGE
2DE classica
DIGE
1°
esp
1°
esp
Totale 9 gel
2°
esp
Totale 18 gel
3°
esp
2°
esp
3°
esp
< tempo di analisi software, > precisione
Analisi software
Esistono numerosi software in grado di analizzare
gel DIGE
Decyder (GE Healthcare)
PDQuest (Biorad)
Progenesis Samespot (Nonlinear Dynamics)
Delta 2D (Decodon software)
Applicazioni
DIGE
Studio fosforilazione e DIGE
• Tramite DIGE è possibile studiare con
precisione maggiore rispetto alla 2DE classica
anche PTM di proteine
• Studio su una forma mutante di tropomiosina
(E54K) espressa da topi transgenici.
• La proteina mutante possiede un differente
pattern di fosforilazione visualizzabile con la
comparsa nella mappa 2D di forme non
fosforilate
Warren et al. Proteomics 2008
Identificazione tramite Bottom-up
Esistono due differenti approcci basati sull’utilizzo della spettrometria di massa per
l’identificazione proteica, rispettivamente indicati con le locuzioni “top-down” e “bottom-up”
La metodica “top-down” prevede
l’utilizzo di una proteina intatta che
viene frammentata direttamente
all’interno dello spettrometro di massa
L’approccio “bottom-up” prevede
l’analisi dei peptidi derivanti dalla
digestione delle proteine. I peptidi
vengono utilizzati sia direttamente per
rintracciare le molecole proteiche
all’interno di specifici database (PMF),
oppure di effettuare il riconoscimento
attraverso il processo di
frammentazione degli oligopeptidi in
spettrometria tandem
Top-down
Tale metodica prevede l’analisi della proteina intatta, la cui frammentazione avviene direttamente nello
spettrometro di massa. In particolare, la frammentazione della molecola genitore crea una serie di ioni figli
dalle cui masse si traggono le informazioni che consentono di risalire alla sequenza amminoacidica.
La procedura “top-down” richiede una elevata accuratezza e, pertanto, rende necessario l’uso di particolari spettrometri di
massa, quali lo spettrometro con analizzatore a risonanza ionica ciclotronica in trasformata di Fourier (FT-ICR), associato
con un sistema di ionizzazione ESI.
Gli strumenti FT-ICR sono in grado di intrappolare gli ioni utilizzando un campo magnetico statico, prodotto da un
magnete superconduttore. In questo campo magnetico gli ioni sono “forzati” a mantenere un moto circolare con una
caratteristica frequenza orbitale, dipendente dallo specifico rapporto m/z. Tale tipo di analizzatore, come la trappola
ionica, consente di ottenere sia spettri di massa, che spettri di massa/massa, con una risoluzione molto elevata
Vantaggi
Questo approccio effettua analisi di MS/MS sull’intera proteina, ottenendo informazioni relative anche ad eventuali
modificazioni post-traduzionali.
Non si ha perdita di frammenti che può invece verificarsi quando l’analisi viene condotta sulla miscela di oligopeptidi
ottenuti mediante digestione proteolitica della proteina in esame, così come nella procedura “bottom up”.
Svantaggi
Seppure questo tipo di approccio, per le sue caratteristiche, sia in forte crescita, esistono delle grandi limitazioni, in
parte dovute all’alto costo, ma anche derivanti dalla non ancora soddisfacente disponibilità di algoritmi utili per ricavare
tutte le informazioni necessarie.
Bottom-up
L’approccio Bottom-up è quello che viene usato in proteomica quantitativa
Metodologie basate su spettrometria di massa
ICAT
Isotope-Coded Affinity Tagging
iTRAQ
Isotope Tagging for relative and
Absolute protein Quantitation
SILAC
Stable Isotope Labelling by
Aminoacid in Cell colture
SELDI-TOF
L’analisi
SELDI-TOF-MS
“Surface Enhanced Laser Desorption Ionizzation Time Of
Flight Mass Spectrometry”
tra le nuove tecniche di spettrometria di massa, sta acquistando un ruolo crescente negli
studi clinici, soprattutto per la sua rapidità di analisi e la capacità di analizzare un grande
numero di campioni in tempi relativamente brevi (“high-throughput”).
Essa nasce dalla combinazione della tecnica MALDI-TOF-MS con la cromatografia di
superficie ed offre il vantaggio di eseguire rapidamente l’analisi diretta del profilo proteico di
campioni biologici in volumi molto piccoli.
SELDI-chip
Nell’analisi SELDI-TOF-MS, i peptidi e le proteine presenti nel
campione si legano in modo specifico ad un chip proteico in
base alle proprie caratteristiche biochimiche, in quanto la
superficie del chip è “funzionalizzata” con gruppi chimici
opportuni.
Superfici chimiche
(Hydrophobic)
(Anionic)
(Cationic)
(Metal Ion)
Superfici biologiche
(PS10 or PS20)
Carbonyldiimidazole
(Antibody - Antigen)
(Receptor - Ligand)
(DNA - Protein)
SELDI-TOF
SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
2
Il campione biologico viene
applicato sui chip con capacità
di ritenzione differente
1
4
Analisi statistica multivariata : PCA,
clustering
3
Le proteine vengono ionizzate
e rilevate tramite spettrometria
di massa a tempo di volo
Gli spettri di massa sono normalizzati e
confrontati mediante procedure
informatiche
SELDI-TOF caratteristiche
•
Elevata resa analitica
•
Utilizzo di piccole quantità di campione
•
Basso potere di risoluzione
•
Studio di campioni non frazionati
•
Validazione bioinformatica non standardizzata
•
Non si identificano le proteine
•
Range di massa 1500-20000 Da
Applicazioni SELDI-TOF
BN-GEL
Con la proteomica si cerca di
riconoscere le proteine, ma anche
segnarne la sua funzione e descrivere la
sua relazione con altre proteine. Molte
proteine sono organizzate spazialmente
per formare complessi e ben distribuite
ed assemblate nella membrana
Il problema per l’analisi di queste proteine è
la loro solubilizzazione e separazione senza
perdere attività e caratteristiche
Nel 1991 Schagger e Von Jagow hanno elaborato una tecnica per l’analisi di complessi proteici
e di proteine a bassa solubilità ed inizialmente usata per studiare e separare i complessi
mitocondriali senza dissociarli nei loro costituenti polipeptidici
BN-GEL
Tale tecnica si basa sul fatto che viene aggiunto il Blue Coomassie al tampone di corsa (catodico) e questo si
lega al complesso proteico conferendo una carica negativa che le fa migrare verso l’anodo ma
contemporaneamente non lo denatura.
Blue
Native
Il Blue Coomassie si lega alla superficie del complesso avendo proprietà idofobiche, ma nello stesso tempo
è sufficientemente solubile in solvente acquoso e la separazione che si ottiene non è dovuta al rapporto
massa/carica, ma in base alla grandezza del complesso.
Il tampone di solubilizzazione è composto da:
DETERGENTE- APOLARE
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside o la Digitonina
Sale Zwitterionico
acido amino-capronico con carica 0 a pH7
A metà corsa si cambia il
tampone di corsa al
catodo aggiungendolo
senza Coomassie
Dopo la 1°separazione si equilibrano le strisce in
SDS in presenza di mercaptoetanolo