ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’ INGEGNERIA GENETICA Applicazioni DNA ricombinante: Grandi quantità di proteine Applicazioni principali delle proteine ricombinanti -PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita). -PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (enzimi). -REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA. Sistemi di espressione Procariotici (E.Coli) Eucariotici: Saccharomyces Cerevisiae (lievito) Cellule di insetto (Baculovirus) Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.) Animali transgenici Piante transgeniche PROTEINE DI FUSIONE Problematica: •Purificazione Un TAG è una sequenza proteica con proprietà che ci permettono di purificare la proteina d’interesse TAG TAG DIMENSIONE LIGANDO GST 25 kDa glutatione MBP 40 kDa amilosio FLAG (DYKDDDDK) 8 aa Anticorpo monoclonale specifico His-tag 6-10 aa Ni2+ GST (Tag) PROTEINE DI FUSIONE GST PTP Dominio catalitico PTP1B NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI Forti – Alta affinità per l’RNA polimerasi TRASCRITTO ALTA FREQUENZA Regolabile – L’espressione può essere controllata dallo sperimentatore, tramite induttori e repressori UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA PROVOCA: -inibizione funzioni cellula -perdita energia -perdita plasmide Lattosio IPTG ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE 1. TRASFORMAZIONE DEL VETTORE D’ESPRESSIONE (CODIFICANTE PER LA PROTEINA DI FUSIONE) IN OSPITE. 2. AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO. 3. INDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE. 4. PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE. 1. TRASFORMAZIONE Assunzione di DNA da parte di un organismo Amp Gene di interesse E. Coli 1. TRASFORMAZIONE 2. AMPLIFICAZIONE 12-16 ore 37°C 2-5x109 cellule (N = N02n) LB: Lysogeny Broth (Luria Broth) Tryptone (fonte aminoacidica) Estratto di lievito (vitamine e elementi in tracce) NaCl Time (h) FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano) FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono assorbanza 3. INDUZIONE DILUIZIONE 1:100 IPTG 2 ore 4. PURIFICAZIONE LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA supernatante 1. Recupero batteri 10’ Pellet (batteri) 4000 rpm congelamento/scongelamento Lisozima (agisce sulla membrana esterna) 2. Lisi Sonicazione (ultrasuoni) detergenti Pellet (membrane, DNA) 3. Recupero componente proteica 30’ 13000 rpm Supernatante (proteine) Immobilizzazione della proteina di fusione su supporto solido ESTRATTO PROTEICO GLUTATIONE IMMOBILIZZATO SU BIGLIE DI SEFAROSIO RIMUOVO IL SUPERNATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE 3000 RPM + LAVAGGI con PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA loading buffer 95° C + 13000 rpm •L’ELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO •L’SDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI •IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALI PONTI DISOLFURO + CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL SUPERNATANTE CONTENENTE LA PROTEINA Loading buffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8 2% SDS 10% Glycerol 1% b-Mercaptoethanol 12.5 mM EDTA 0.02 % Bromophenol Blue 5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA SDS-PAGE (Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) POZZETTI PER CARICAMENTO TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8 STACKING GEL ACRILAMIDE 4% SDS TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8 SEPARATING GEL ACRILAMIDE > 5% SDS + STACKING GEL RUNNING GEL Stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza. Running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore. IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA 25 mM Tris HCl pH 8.3 192 mM Glicina 0.1% SDS Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica negativamente e comincia a migrare con una certa velocità Gly Gly ClCl- Gly Gly Cl- ClCl- pH 8.3 ClCl- Arrivata al loading buffer e allo stacking (entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Clsono la specie più veloce pH 6.8 pH 8.8 Cl- Cl- Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse in una regione ad elevata mobilità elettroforetica Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il colorante lega arginina, istidina e aminoacidi aromatici, rendendo visibili le proteine su gel in base alla loro quantità. APPLICAZIONI 1. SI PUO’ SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER ESPERIMENTI DI PULL DOWN 2. SI PUO’ ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI SEFAROSIO E UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI 3. SI PUO’ SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO AZIONE DEL LISOZIMA Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in tessuti animali dotato di attività battericida. Lisa la parete batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra l’acido N-acetilmuramico (NAM) e la N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente principale delpeptidoglicano. PARETE Gram- LISOZIMA RUOLO DELL’SDS NELLA CORSA LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA PROTEINA NATIVA PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA L’unico determinante della velocita’ di migrazione è la sua massa.