STUDIO DELLE PROTEINE
cromatografia
Frazionamento
Metodi non meccanici:
:
centrifugazione
Chiarificazione dell’estratto
• L’estratto grezzo deve essere “pulito” prima di procedere
al frazionamento
• Conviene allontanare subito gli acidi nucleici, ribosomi
mediante precipitazione (protamina solfato)
• Nel caso contiene molto materiale insolubile si può
centrifugare
• Molto efficaci sono le tecniche che sfruttano la diversa
solubilità delle singole proteine
Sviluppo passaggi di purificazione
• Solubilità differenziale
m= 1/2SciZ2i
METODI DI PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE
• Punto isoelettrico
• Calore
• Precipitazione frazionata con Sali
(salting-in/salting out)
• Solventi organici
• Con polimeri organici (PEG)
• pH estremi
Esempio di precipitazione frazionata
• Sviluppo di passaggi cromatografici
• Per stabilire la tecncica cromatografia più utile per la
nostra proteina bisogna tenere conto di alcuni parametri
generali:
-la capacità e la resa del processo
cromatografico;
-la diluizione della proteina nel passaggio
cromatografico;
-la velocità,
-la conservazione dell’attività durante il passaggio;
-il costo dell’intero processo.
Criterio generale:
assemblare una serie di passaggi che separano le
proteina secondo proprietà diverse.
Concentrazione per ultrafiltrazione e conservazione
• La concentrazione si realizza forzando acqua e piccole
molecole attraverso una membrana semipermeabile
usando alta pressione o centrifugazione.
•
• Sono disponibili commercialmente diverse membrane
con intervallo di peso molecolare tra 500 e 300.000
(Amcon, Millipore) con dimensioni di pori 0,1-10 mm.
• Le proteine purificate in genere vengono conservate a
basse temperature (-80°C). Spesso si aggiungo agenti
criogeni (glicerolo, glicole etilenico, DMSO) per
stabilizzare la proteina durante il congelamento e
scongelamento.
Dialisi