Legame di un ligando al braccio spaziatore
legato alla matrice
L’immobilizzazione può provocare l’inattivazione del ligando perché ne
altera la struttura tridimensionale o rende inaccessibile il sito di legame
NON SPECIFICA:
si basa su variazioni di pH, della forza ionica o
sull’aggiunta di un agente denaturante
SPECIFICA:
si aggiunge un competitore, vale a dire un composto
che ha una maggiore affinità per la molecola da
purificare rispetto al ligando legato covalentemente
alla matrice
CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
per purificare una ribonucleasi
pirimidina
Analogo del substrato
legato covalentemente
alla resina
o aggiunta del
competitore
VANTAGGI
• Possibilità di caricare grandi volumi
• Eluizione del composto di interesse in un piccolo volume
• Elevata specificità di selezione
SVANTAGGI
• Esecuzione in più tempi
• Richiesta conoscenza delle caratteristiche della molecola
da selezionare (meccanismo d’azione, affinità per altri
ligandi, ...)
• Eluizione in un tampone a pH e/o forza ionica diversi dal
tampone iniziale
• In molti casi il campione eluito è contaminato dall’agente
“spiazzante”
Purificazione delle proteine sulla base
delle loro dimensioni molecolari
 Gel-filtrazione
 Dialisi
Ultrafiltrazione
La soluzione contenente la proteina di
interesse è posta in un tubo composto
da una membrana semipermeabile di
nitrato o acetato di cellulosa.
Le molecole di sale, essendo piccole,
possono diffondere facilmente
attraverso la membrana e si
distribuiranno ai due lati della
membrana stessa fino a raggiungere
una uguale concentrazione nei due
ambienti della cella di dialisi.
La soluzione contenente la proteina di interesse è posta in una cella caratterizzata dal
possedere, alla sua base, una membrana semipermeabile poggiante su un supporto
inerte.
Il campione è fatto passare attraverso la membrana e raccolto in un piccolo
contenitore. Tale obiettivo può essere raggiunto applicando la pressione di un gas alla
miscela.
Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
CARICA ELETTRICA
AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE
SOLUBILITA’
Le proteine possono essere frazionate
sulla base della loro solubilità
Frazionamento con sali
Frazionamento con solventi organici
Frazionamento con polimeri organici
Frazionamento per denaturazione al calore
Frazionamento in base al punto isoelettrico
Ottima procedura iniziale per l’allontanamento della
maggior parte dei contaminanti
 E’ condotto con piccole aggiunte di un sale appropriato
 L’ammonio solfato è il sale più utilizzato, in quanto molto
solubile in acqua, disponibile con un buon grado di purezza
ed economico
 Dopo ogni aggiunta di sale bisogna essere sicuri di ottenere
una soluzione omogenea con il sale completamente sciolto
 La proteina precipitata è centrifugata e risospesa in
un’opportuna soluzione tampone
 Per ridurre al minimo la denaturazione, tutti i passaggi sono
condotti tra 0°C e 10°C
Tale termine inglese indica quel fenomeno per il quale una data proteina,
normalmente, precipita in un piccolo intervallo di concentrazione di sale
(di solito ammonio solfato).
Il fenomeno è da attribuire al fatto che le interazioni proteina-proteina
divengono predominanti rispetto alle interazioni proteina-acqua e
acqua-sale.
L’addizione di sale rimuove il sottile strato di molecole di acqua dalla
superficie della proteina, consentendo ai gruppi idrofobici di causare
l’aggregazione delle proteine e quindi la precipitazione.
La presenza di gruppi idrofobici in una proteina risulta fondamentale per
il processo di salting out.
Il frazionamento con sali si rivela utile come passaggio solo quando le proprietà
di solubilità della proteina di interesse sono diverse da quelle della maggior
parte delle proteine contaminanti presenti nell’estratto.
Poiché la precipitazione con sali dipende sia dalla concentrazione della proteina
nell’estratto grezzo sia dalla temperatura, tali parametri devono essere
controllati attentamente affinché il procedimento sia riproducibile.
L’aggiunta del sale ammonio solfato alle soluzioni provoca una diminuzione del
pH ed è dunque consigliabile monitorare spesso il pH.
 Portare l’estratto grezzo ad una concentrazione di ammonio solfato appena al
di sotto di quella necessaria a precipitare la proteina di interesse
 In tal modo, le proteine che precipitano sono allontanante mediante
centrifugazione
 La concentrazione di ammonio solfato è poi aumentata in modo da far
precipitare la maggior parte della proteina di interesse in un intervallo di
tempo ragionevole
 La proteina precipitata viene recuperata mediante centrifugazione
La solubilità delle proteine varia
con la concentrazione salina
Solubilità proteina
NaCl
Na2SO4
(NH4)2SO4
[SALE]
Aggiunta di sale/ Aggiunta di sale/
centrifugazione centrifugazione
Proteine del siero
Fibrinogeno: 0.8 M (NH4)2SO4
Albumina: 2,4 M (NH4)2SO4
 Si basa sulle differenze nella solubilità delle diverse proteine in soluzioni acquose di
solventi organici quali etanolo, acetone, butanolo ed il glicole polietilenico (PEG)
PEG = HO(CH2CH2O)nH (polimero organico)
 Il solvente organico abbassa la costante dielettrica del mezzo, determinando un
incremento delle interazioni elettrostatiche tra diverse proteine a discapito delle
interazioni proteina-acqua
 DUNQUE LA SOLUBILITA’ DI UNA PROTEINA DIMINUISCE
 Il frazionamento con solventi organici in un certo senso è l’inverso del frazionamento
con sali: nel primo, i gruppi idrofobici delle proteine sono mascherati dal solvente
organico mentre i gruppi ionici diventano dominanti; nel secondo, i gruppi idrofobici
vengono progressivamente esposti
SVANTAGGI: la tecnica provoca la denaturazione o l’inattivazione di molte proteine.
Tuttavia per quelle proteine che sopravvivono al trattamento, questi
possono essere passaggi potenti di frazionamento.
 Si basa sulla minore solubilità delle molecole proteiche a valori di pH pari al loro
punto isoelettrico
 A tale valore di pH una proteina possiede un numero uguale di cariche positive e
negative, per cui risultano minimi gli effetti repulsivi e massime le interazioni
intermolecolari, le quali determinano la formazioni di aggregati insolubili
 Tale proprietà può essere usata per precipitare selettivamente la proteina di
interesse
 Ovviamente la proteina di interesse dovrebbe possedere un pI molto diverso da
quello della maggior parte delle proteine cellulari
 SVANTAGGIO: la proteina precipitata inevitabilmente si denatura
 Dunque sarebbe preferibile adoperare il metodo per rimuovere le proteine
contaminanti, aggiustando il pH dell’estratto in modo tale da precipitare
queste proteine e non la proteina in esame
 Si basa sulle differenze nella sensibilità al calore
 La temperatura alla quale la proteina di interesse va incontro a denaturazione è
determinata in un esperimento pilota su piccola scala
 Una volta determinata tale temperatura critica, le proteine contaminanti termolabili
sono allontanate scaldando la miscela ad una temperatura di 5-10°C inferiore alla
temperatura critica, per 15-30 minuti
 Le proteine denaturate con questo processo sono rimosse per centrifugazione
 La presenza del substrato, del prodotto o di un inibitore competitivo spesso
stabilizzano un particolare enzima, per cui è possibile utilizzare anche temperature
più alte