Laboratorio Integrato II Modulo di Biochimica Programma delle esercitazioni • Determinazione della costante di affinità dell’eme per la sieroalbumina umana • Separazione di proteine in miscela mediante cromatografia a scambio ionico Determinazione della costante di affinità dell’eme per la sieroalbumina umana • Stechiometria: numero di ligandi per proteina • Affinità: stabilità relativa del complesso. Descritta dalla costante termodinamica di equilibrio P+L PL PL Ka P L P L Kd PL L P Kd PL PL L P L P PL P L P K d P L P K d L CP Kd L K d L C P L PL K d L x y ax [PL] 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Kd 0 20 40 60 [L] 80 100 120 [PL] La concentrazione di proteina deve essere dell’ordine di grandezza della Kd 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 CP=2 CP=10 CP=50 CP=100 0 20 40 60 [L] 80 100 120 PL L ( Lt PL) Pt K d L K d ( Lt PL) 2 1 1 1 1 2 Amax K d Lt N Pt K d 1 K d Lt N Pt K d 1 4 K d Lt N Pt A 2 K d1 Lt Misura dell’assorbimento Io I Sorgente Monocromatore Campione Ricevitore Monocromatore 2 1 1 1 1 2 Amax K d Lt N Pt K d 1 K d Lt N Pt K d 1 4 K d Lt N Pt A 2 K d1 Lt Separazione di proteine in miscela mediante cromatografia a scambio ionico Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE Valvole di iniezione L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie. A seconda del loop montato varia il volume del campione iniettato in colonna Rivelatore UV a l fissa La radiazione proveniente da una lampada a vapori di Hg passa attraverso la cella del campione e arriva al fotodiodo. L’intensità della luce assorbita è proporzionale alla concentrazione dell’analita. Vantaggi e svantaggi Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254/280 nm. Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a l fissa. Cromatografie di adsorbimento • Interazione idrofobica • Scambio ionico • Per affinità – Affinità per ligandi (anticorpi) – Proteine ingenierizzate (His-tag) • Immobilized Metal ion Affinity Chromatography Coefficiente di partizione - • Il coefficiente di partizione tra le due fasi, , è definito come il rapporto tra il soluto adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a quello in soluzione nella fase mobile. = 0 nessun adsorbimento = 1 tutto adsorbito Cromatografia di scambio ionico • Scambio anionico – A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. – L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare). • Scambio cationico – A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. – L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH. Scambiatori ionici Cromatografia di scambio ionico Cromatografia di scambio ionico • VANTAGGI – Per grandi volumi, – Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), – Matrice molto robusta, – Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. • SVANTAGGI – Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. – Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali. All’esame… • Il candidato descriva l’esperimento atto a determinare la costante termodinamica di dissociazione della emoverdina (che assorbe a 460 nm, ε = 1×105 cm-1 M-1) con la HSA sapendo che in letteratura è riportato che lo stesso ligando si lega all’albumina bovina con Kd ≈ 10-6 M. All’esame… • Descrivere un protocollo di purificazione di una proteina avente pI = 9.8 mediante cromatografia di scambio ionico, sapendo che la maggioranza delle proteine presenti nel campione possiede pI compreso tra 5 e 8.
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