come separare questi oggetti
1
Forma
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Grandezza
Densità
lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone
1
2 3
forma
6
grandezza
4 5 6
4
7 8
Densità
5
7
9
10 11
cotone
8
4
8
lana
pietra
5
12
Diversa grandezza
Differente sedimentazione
Differente velocità
di rotolamento
Juang RH (2004) BCbasics
Basic Principles of Protein Purification
Organelle
Cell
Homogenization
Small molecule
Amino acid, Sugar,
Nucleotides, etc
Macromolecule
Nucleic
acid
Protein
Ammonium sulfate
Size
Gel filtration,
SDS-PAGE,
Ultrafiltration
Charge
Carbohydrate
(Lipid)
Cell
Debris
fractionation
Polarity
Affinity
Ion exchange,
Reverse phase
Affinity
Chromatofocusing, chromatography, chromatography,
HIC,
Disc-PAGE,
Hydroxyapatite
Salting-out
Isoelectric focusing
Juang RH (2004) BCbasics
pompa
Schema a Blocchi di un Sistema
Cromatografico
colonna
RIVELATORE
Soluzione di eluizione
Collettore di frazioni
Scambio ionico: separazione
in funzione della carica
Importanza del pI
• -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è
carica negativamente e si lega a una
resina a scambio anionico (SCAMBIO
ANIONICO).
• -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è
carica positivamente e si lega a una resina
a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).
Eluizione:
-Variazione di pH
-Variazione forza ionica
-ioni competitivi
Scambiatrice di anioni:
-pH decrescente
-forza ionica crescente
-anioni competitivi
Scambiatrice di cationi:
-pH crescente
-forza ionica crescente
-cationi competitivi
Cromatografia di scambio ionico
• VANTAGGI
– Per grandi volumi,
– Grandi quantità di
proteina (1-5 g proteina
per 100 ml),
– Matrice molto robusta,
– Condizioni molto
flessibili, possibili molte
variazioni.
• SVANTAGGI
– Proteine allo stesso pH e
concentrazioni di sali della
colonna.
– Ciò può essere scomodo
poiché poi occorre passare
in dialisi per togliere i sali.
GEL FILTRAZIONE
Gel filtrazione
Una proteina
sconosciuta
eluisce a 170
mL:
40,000 Da (40KDa)
Cromatografia di affinità
Resina
HO
O
HO
O
OH
Braccio spaziatore
O
OH
OH
OH
OH
Ligando
Cromatografia
di affinità
• Un ligando ad alta affinità
per la proteina è legato alla
matrice
• La proteina di interesse si
lega al ligando e viene
immobilizzata sulla colonna
• Le altre proteine vengono
“lavate” via.
• La proteina di interesse
viene eluita usando una
soluzione di ligando.
Cromatografia di affinità
• VANTAGGI
• Alta affinità, costanti
di dissociazione
nell’ordine del mM,
nM o anche pM.
• Legame tutto o
nulla:
• Possibili molte
variazioni (affinity
tags)
• SVANTAGGI
• L’ingombro sterico spesso
abbassa la capacità
• Il braccio spaziatore può
avere influenza sul legame
• L’eluizione può richiedere un
eluente specifico
Affinity tags
•
Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine
ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità
con un ligando:
• TAG
–
–
–
–
–
GST
MBP
biotina
Poli-His
Proteina A
• LIGANDO
–
–
–
–
–
Glutatione
Maltosio
Avidina
Nichel, Zinco
Anticorpi
• Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per
cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna.
• Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag
attraverso proteolisi specifica.
Cromatografia di affinità con anticorpi
Matrici attivate per immobilizzare
uno specifico ligando
Protocollo generale di
purificazione proteine
Obiettivi:
• Cattura
– Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio
• Purificazione intermedia
– Eliminare la maggior parte dei contaminanti
• Polishing
– Ottenere la massima purezza possibile
CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE
MEDIANTE ELETTROFORESI
Gas cromatografia
(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)
Schema a blocchi di un
gascromatografo
Esempio – separazione gascromatografica di urina di
paziente con elevata aciduria