Concetti basilari per lo studio del binding
recettoriale
I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti.
Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando
radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il
complesso RD secondo l’equazione
R+D
RD
Quando il sistema raggiunge l’equilibrio in ogni provetta avremo:
Radioligando
Tessuto
Tampone
di incubazione
Incubazione
Ligando radiomarcato D
Equilibrio
Recettore RD
Recettore libero R
Il recettore libero R non potrà essere misurata ma possiamo
misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.
Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria
un’operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità
di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al
tessuto (Free).
Equilibrio
Separazione
Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione
Filtrazione
Il metodo più semplice e classico è quello della
filtrazione su membrane in fibra di vetro
Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità 0.7 mm-2.7 mm
Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando
aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa
attraverso la membrana.
Limiti e precauzioni della filtrazione
Le proteine ostruiscono il filtro
Il ligando radiomarcato tende a legarsi alle fibre del filtro.
Elevata velocità di filtrazione (deve essere completata in 4-5
secondi per evitare che il ligando radiomarcato si stacchi dal
recettore. In genere si perde il 5% di RD)
Centrifugazione
Limiti e precauzioni della centrifugazione
Una certa quantità di ligando radiomarcato (Free) potrebbe
restare intrappolato nel pellet.
Numero limitato degli alloggi nel rotore
Dialisi
Viene impiegata quando il recettore ha bassa affinità per il ligando
radiomarcato (micromolare).
Una piccola membrana simile alla cellulosa da dialisi separa
due camere
L
L
R
R
L
R
L
L L
L
La membrana è scelta in modo tale che il ligando possa
passare mentre il recettore viene trattenuto.
Il ligando diffonde fino a raggiungere l’equilibrio.
Nella camera azzurra [L] sarà Ligando libero
Nella camera gialla [L]= ligando libero +ligando legato
La differenza fra questi valori è la concentrazione di ligando
legato.
Quella che viene misurata è la deplezione di ligando libero
Cromatografia per esclusione
Viene impiegata quando il recettore ha elevata affinità per il
ligando radiomarcato (picomolare).
Studi di binding
Analisi di saturazione
• Analisi di Scatchard
• Analisi di Hill
Analisi cinetica
• Cinetica di associazione
• Cinetica di dissociazione
Analisi di competizione
Analisi di saturazione
Kon
Recettore-Ligando
Recettore + Ligando
Koff
Il binding avviene quando ligando e recettore collidono mediante
diffusione e quando la collisione ha un corretto orientamento e
sufficiente energia. La velocità di associazione è data dal
numero di eventi di binding per unità di tempo
Von = [Ligando] × [Recettore] × kon
Una volta avvenuto il binding, ligando e recettore restano legati
per un certo periodo di tempo.
La velocità di dissociazione del complesso è data dal
numero di eventi per unità di tempo
Voff = [ligando-recettore] × koff
Dopo la dissociazione il ligando e il recettore non devono aver
subito modifiche.
All’equilibrio avremo:
Von = Voff
[Ligando] × [Recettore] × kon = [Ligando-Recettore] × koff
Riarrangiando l’equazione avremo:
[Ligando] [Recettore]
Koff
=
=
Kon
[Ligando-Recettore]
Kd
Per meglio comprendere il significato della Kd poniamo
[Ligando] = Kd
L’equazione pertanto diviene:
[Recettore]
[Ligando-Recettore]
da cui si evince che:
=
1
[Recettore] = [Ligando- Recettore]
Quando [Ligando] = Kd la quantità di recettore libero è
esattamente uguale alla quantità di recettore occupato.
I recettori totali sono la somma di quelli liberi più quelli legati al
ligando, e quando [Ligando] = Kd avremo che metà della
popolazione recettoriale sarà occupata all’equilibrio.
Se il ligando ha elevata affinità per il recettore, la Kd sarà
piccola perché basterà una piccola concentrazione di ligando per
legare la metà dei recettori.
Non bisogna confondere la Kd (costante di dissociazione
all’equilibrio) con Koff (costante di dissociazione). Non sono la
stessa cosa ed hanno dimensioni differenti.
Kon = costante di associazione (molare-1 min-1)
Koff = costante di dissociazione (min-1)
Kd = costante di dissociazione all’equilibrio (molare)
La legge di azione di massa permette di definire la frazione di
recettore occupata all’equilibrio in funzione della concentrazione
di ligando.
Frazione recettoriale occupata
[RL]
[Rtot]
=
[RL]
[R] + [RL]
Questa equazione non è utile perché non conosciamo la
concentrazione di recettore libero.
Poiché
[R] = [Rtot] - [RL]
e sapendo che:
[R] [L]
Kd =
[RL]
[R] [L] ([Rtot] - [RL]) [L]
[RL] =
=
Kd
Kd
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
[RL] Kd + [RL] [L] = [Rtot] [L]
[RL] (Kd + [L] ) = [Rtot] [L]
[RL] =
[Rtot] [L]
Kd + [L]
da cui la frazione recettoriale occupata [RL]/ [Rtot] sarà:
[Ligando]
[RL]
[Rtot]
[Ligando]
=
Ligando + Kd
Frazione recettoriale occupata
0
0%
1Kd
50%
4Kd
80%
9Kd
90%
99Kd
99%
La legge di azione di massa è un modello semplice che può
essere usato per spiegare alcuni dati sperimentali e non è utile in
tutte le situazioni.
Il modello assume che:
Tutti i recettori sono ugualmente accessibili al ligando
I recettori sono liberi o legati con il ligando. Non devono esserci
differenti stati di affinità recettoriale o di binding parziale
Il binding non deve alterare il ligando o il recettore
Il binding deve essere reversibile
Informazioni provenienti dall’analisi di saturazione
KD
Indica la concentrazione di radioligando che all’equilibrio
occupa il 50% dei recettori presenti nel preparato
biologico
Bmax
Indica la densità recettoriale nel tessuto studiato. Si
esprime in moli/mg di proteina.
Approccio sperimentale all’analisi di saturazione
L’esperimento di saturazione viene effettuato determinando il
Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti
concentrazioni di ligando radiomarcato.
Binding Totale
Viene definito aggiungendo al tessuto concentrazioni crescenti di
radioligando
Binding Non-Specifico
Viene definito in presenza di ligando non marcato ad elevata
concentrazione alla quale tutto il radioattivo viene spiazzato dai
siti specifici di legame
Esempio: Vogliamo determinare il binding specifico all’equilibrio
per un determinato radioligando alla concentrazione di 0.5 nM
Provetta 1 (Binding totale)
Tessuto + Rx (0.5 nM)
Lettura radioattività =2500 cpm
Provetta 2 (Binding non specifico)
Tessuto + Rx (0.5 nM) + Ligando non marcato (10 mM)
Lettura radioattività= 500 cpm
Alla concentrazione 0.5 nM di RX il complesso RD (Binding
Specifico, Bound) sarà : 2500-500= 2000 cpm.
Il valore 500 cpm rappresenta la quantità di RX che si è legato
a siti non specifici di legame.
Infatti
l’impiego
del
ligando
non
marcato
ad
levata
concentrazione spiazza RX solo da tutti i siti specifici ma non
da quelli non specifici.
Realizzando differenti concentrazioni di RX e definendo per
ciascuna il Binding Totale e il binding Non-Specifico si
calcola il Binding Specifico.
Bound
(pmol/mg protein)
0.15
Binding totale
Binding non specifico
Binding specifico
0.10
Le tre curve corrispondenti
sono riportate in figura
0.05
0.00
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
[3H]spiroperidolo, (nM)
Visualizzando solo la
curva
del
binding
specifico
possiamo
individuare la Kd e la
Bmax
Bound
(pmol/mg protein)
0.100
0.075
Bmax
0.050
0.025
0.000
0.00
Kd
0.25
0.50
0.75
[3H]spiroperidolo, (nM)
1.00
Come trasformare i cpm in concentrazione
Esempio:Un campione dal volume totale di un 1 mL fornisce
5000 cpm per un Rx di attività specifica 27 Ci/mmole
cpm
= efficienza (%)
dpm
Conoscendo l’efficienza strumentale (es 55%) 5000 cpm
corrispondono a 9090 dpm
Sapendo che 2.22 x 106 dpm corrispondono a 1 mCi
Avremo che 9090 dpm corrispondono a 4.1 x 10-3 mCi
Dall’attività specifica del radioligando sappiamo che 27 Ci
corrispondono ad 1 mmole. Cioè 27 x 106 mCi ad 1 mmole
Avremo che 4.1 x 10-3 mCi corrispondono a 1.52 x10-10 mmoli
Il campione in esame ha un volume totale di 1 mL
La concentrazione sarà: 1.52x10-10 M (0.152 nM).
Analisi di Scatchard
Partendo dall’equazione:
[Rtot] [L]
[RL] =
Kd + [L]
[RL] ([L] + Kd ) = [L] [Rtot]
[RL] [L] + [RL] Kd = [L] [Rtot]
dividendo tutto per [L] Kd avremo:
[RL] [L]
[L] Kd
+
[Rtot] [L]
[RL]Kd
[L] Kd
=
[L] Kd
quindi:
[RL]
[L]
[Rtot]
=
Kd
-
[RL]
Kd
Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL];
con Bmax la quantità massima di ligando legato [Rtot];
con F la quantità di ligando libero [L]
avremo:
B
_ B + Bmax
=
F
Kd
Kd
Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando legato
e ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando legato (B)
avremo:
1.00
B/F
0.75
0.50
Bmax
0.25
0.00
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
0.150
Bound
Si ottiene una retta con
Slope = -
1
Kd
L’intercetta sull’asse delle ascisse (B/F = 0) permette di
ricavare Bmax che rappresenta la densità recettoriale.
Se è presente un solo tipo di recettore lo Scatchard sarà
lineare.
Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale
concentrazione ma con differenze in Kd per il radioligando
avremo:
B
Binding specifico
A
1.00
0.75
B/F
0.50
0.25
0.00
0.000 0.025
[radioligando]
0.050 0.075
0.100 0.125 0.150
Bound
Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e azzurro
mentre in nero la curva somma del binding totale.
Nel grafico di Scatchard (B) la linea nera del binding totale
(inteso come somma del binding specifico delle popolazioni
recettoriali esistenti) evidenzia una curvatura e le due linee
tratteggiate rappresentano il binding specifico di ciascun
recettore.
Dall’analisi di Scatchard si può determinare l’omogeneità di
una popolazione recettoriale (sempre che vi siano differenze
evidenti tra i valori di Kd del radioligando per ciascun recettore).
In caso contrario avremo un’informazione apparente (di un’unica
popolazione recettoriale).
La soluzione del problema è realizzata ovviamente da
radioligandi selettivi per ciascun tipo di recettore presente.
Analisi di Hill
Considerando l’equazione:
[Rtot] [L]
[RL] =
Kd + [L]
che può essere scritta:
[RL] [L] + [RL] Kd = [Rtot] [L]
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
[RL] =
[L] ([Rtot] - [RL])
Kd
da cui:
[RL]
=
[Rtot] - [RL]
[L]
Kd
se il ligando L interagisce con n siti secondo l’equazione
nL + R
avremo:
[RL]
RLn
=
[Rtot] - [RL]
B
Bmax - B
[L]n
Kd
=
[L]n
Kd
passando ai logaritmi:
B
log
=
n log [L] - log Kd
Bmax - B
dove n è il coefficiente di Hill (nH)
Se esiste un solo sito di
interazione per recettore (n =1)
si ha una retta con pendenza = 1
B
log
Bmax - B
Per calcolare la Kd
bisogna porre
log
B
=0
Bmax - B
0
pendenza = nH
log [L]
Analisi cinetica
Binding di associazione
L’esperimento cinetico di associazione viene effettuato per
determinare la costante di velocità di associazione Kon e lo stato
stazionario.
La quantità di binding aumenta nel tempo fino ad un valore
massimo (Ymax). Questo non corrisponde alla Bmax. Infatti Ymax è
la quantità di binding specifico all’equilibrio per una certa quantità
di ligando usato nell’esperimento di associazione. Bmax è la
quantità massima di binding estrapolata a concentrazioni molto
alte di ligando.
Ymax
5000
cpm
La concentrazione di recettore
libero ad ogni tempo di
misurazione corrisponde alla
Ymax meno il binding specifico
misurato allo stesso tempo.
7500
2500
0
0
10
20
30
tempo (ore)
La velocità con la quale incrementa il binding è dato da tre fattori
(oltre alle condizioni sperimentali come pH, temperatura):
La costante di velocità di associazione Kon (min-1 M-1).
La concentrazione del radioligando.
La costante di velocità di dissociazione Koff (min-1).
Effetto della concentrazione di Rx sul
raggiungimento dello stato stazionario
Binding specifico
Binding di dissociazione
Binding non specifico
tempo
Si porta sistema recettore-radioligando all’equilibrio e poi si
aggiunge il ligando freddo misurando il binding a diversi
intervalli di tempo.
Analisi di competizione
Il binding di competizione viene effettuato per determinare l’affinità
di un ligando per un dato recettore.
Viene utilizzata una concentrazione fissa di RX e di proteine
recettoriali.
Il sistema viene portato all’equilibrio in presenza di
concentrazioni differenti di ligando e quindi viene separato il
legato (Bound) da tutto il resto.
Binding totale
Il binding totale viene determinato in presenza del radioligando (in
questo caso [3H]-8-OH-DPAT) e del solo tessuto.
Binding non specifico
Viene determinato in presenza di 8-OH-DPAT ad elevate
concentrazioni (10 mM) in modo che esso spiazzi dai siti
recettoriali specifici tutto [3H]-8-OH-DPAT.
La radioattività residua è data dal legame non specifico del
radioligando con proteine non recettoriali.
Binding specifico
Viene ottenuto per differenza tra il binding totale e quello non
specifico
Calcolo del valore di IC50
Concentrazione [3H]-8-OH-DPAT 0.81 nM
Binding totale
Binding non specifico
Binding specifico
9200 cpm
920 cpm
8280 cpm
Curva di spiazzamento del composto 8-OH-DPAT
[ ]
8-OH-DPAT
RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento
cpm
percentuale
1 x 10-10
8700
9200-8700
500/8280
6%
1 x 10-9
7500
9200-7500
1700/8280
21 %
1 x 10-8
2500
9200-2500
6700/8280
81 %
1 x 10-7
1800
9200-1800
7400/8280
89 %
1 x10-6
920
9200-920
8280/8280
100 %
Alla concentrazione 1x 10-6 viene definito il binding non specifico (920
cpm) che sottratto al binding totale (9200 cpm) fornisce il binding
specifico (8280 cpm). A questa concentrazione tutto il radioligando è stato
spiazzato dai siti recettoriali specifici (100 %).
Curva di spiazzamento del composto 1
[ ]
Composto 1 RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento
cpm
percentuale
1 x 10-10
9000
9200-9000
200/8280
2%
1 x 10-9
8100
9200-8100
1100/8280
13 %
1 x 10-8
6500
9200-6500
2700/8280
33 %
1 x 10-7
2800
9200-2800
6400/8280
77 %
1 x10-6
1720
9200-1720
7480/8280
90 %
Le curve di spiazzamento da cui ricavare il valore di IC50, si
ottengono riportando in grafico le percentuali di spiazzamento in
funzione del log della dose
% spiazzamento
8-OH-DPAT
Composto 1
IC50 = 3.02 nM
IC50 = 20.6 nM
0
50
100
10 -11
10 -10
10 -9
10 -8
10 -7
10 -6
10 -5
Log dose
Il valore di IC50 indica la concentrazione di ligando in grado di
spiazzare il 50 % di radioligando dai siti recettoriali
all’equilibrio
E’ preferibile esprimere il valore di affinità come Ki in quanto si
eliminano le variabili
- concentrazione del radioligando utilizzato nel saggio di binding
- natura del radioligando impiegato
Equazione di Cheng-Prusoff
IC50
Ki =
[RX]
1+
Kd