STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO
LA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE
- Cromatografia per affinità (saggio in vitro) (es: saggi pull-down)
- Phage display (saggio in vivo)
- Sistema del doppio ibrido di lievito (saggio in vivo)
Concetto di dominio proteico
Un dominio può quindi essere definito come un’unità
strutturale, con ripiegamenti tridimensionali, che
costituisce una unità funzionale autonoma rispetto al
resto della proteina, che di solito è evolutivamente
conservata
I domini proteici vengono di solito identificati e
classificati rispetto alle loro caratteristiche strutturali,
funzionali ed evolutive.
Cromatografia per affinità (saggio in vitro)
Una certa proteina (“esca”) viene immobilizzata su una matrice di supporto
inerte di una colonna cromatografica nella quale viene fatto passare un lisato
cellulare. In genere la proteina “esca” è fusa con un’altra proteina (attaccata alla
matrice solida).
Le proteine (prede) che interagiscono con l’esca sono trattenute nella colonna,
le altre trascinate via. Successiva eluizione aumentando la concentrazione
salina del tampone
ESCA
PREDA
Proteina di fusione
Proteina da individuare
(es: una certa proteina fusa con GST)
CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (saggio di
pull-down)
Tag = GST
CROMATOGRAFIA PER
AFFINITA’ (pull down)
Una “esca” cattura un complesso
proteico
Analisi della/e proteina:
digestione proteolitica e spettrometria
di massa
Colonna con
Glutatione
Phage-display
“Esibizione” di proteine sulla superficie di un batteriofago filamentoso,
es: M13
- Fusione di un gene di una proteina di rivestimento del fago con
l’intero gene (oppure con dominio proteico) di interesse
- Trasfezione in E. coli
- Espressione della proteina ibrida nel rivestimento del fago
COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY
- Produzione di fagi ricombinanti ottenuti clonando miscele di cDNA ottenuti
da tessuti (librerie di espressione specifiche)
- Ogni fago esprime ed “esibisce” una proteina di interesse fusa con quella fagica
COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY
- Per vagliare una proteina di interesse:
- immobilizzazione della proteina su particelle in una colonna
- immobilizzazione della proteina in pozzetti di piastre da microtitolazione
- Ogni fago esprime ed “esibisce” una proteina di interesse fusa con quella fagica
- Mettere a contatto una soluzione con l’intera libreria fagica
- Lavare
- Eluire il fago trattenuto con tampone a determinati pH o forza ionica
- Caratterizzare il fago trattenuto in seguito ad infezione batterica
Applicazioni del Phage display
- studio delle interazioni proteina-proteina
- studio dell’effetto funzionale di varianti amminoacidiche
SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO
L’espressione genica in S. cerevisiae dipende da fattori di trascrizione con 2 domini.
Dominio di legame al DNA (Binding Domain) o BD
Dominio di attivazione della trascrizione (Activation Domain (AD)
Sostituzione dei fattori di trascrizione con proteine di fusione (ognuna costituita
in parte da un dominio del fattore di trascrizione e in parte dalla proteina campione)
Se si verifica interazione tra questa coppia di ibridi si ottiene l’espressione
del gene bersaglio di lievito
Ovvero:
proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono individuate grazie
alla loro capacità di attivare la trascrizione di un gene indicatore
I due vettori ibridi
derivanti dal 2 µ
selezionati in E. coli,
poi introdotti stessa
cellula di lievito,
oppure fusione di 2
ceppi aploidi lievito
Preda o
Il dominio BD si può legare al DNA ma la
trascrizione inizia solo se viene portato AD
nella giusta posizione
SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO
Utilizzo del fattore di trascrizione di lievito GAL4, che legando il
promotore di LacZ permette la trascrizione della β-galattosidasi.
Se c’è interazione tra le due proteine GAL4 attiva entrambi i 2
domini e trascrive il gene LacZ.
Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in
grado di scinderla e le colonie diventano blu.
Interazione tra i 2 domini = GAL4 attivo
β-galattosidasi
Prom
+ X-Gal
Lacz
Si cresce la colonia di lievito blu e si caratterizza il plasmide con inserito il
DNA della proteina preda (o bersaglio)
Clone 1 ibrido inserito in cellule di
lievito
Clone 1 e clone 2 ibridi
inseriti in cellule di lievito
Screening di libreria di ricombinanti
Applicazioni: può rivelare un gran numero di interazioni che possono
facilitare la decifrazione della funzione genica
Possibilità di falsi positivi e negativi da verificare con altri metodi
CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (pull-down)