ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE
DI UNA PROTEINA DI FUSIONE
PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO
DELL’ INGEGNERIA GENETICA
Applicazioni delle proteine ricombinanti
-PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina,
ormone crescita).
-PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (enzimi).
-PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA
PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI.
-REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.
Sistemi di espressione
Procariotici (E.Coli)
Eucariotici:
Saccharomyces Cerevisiae (lievito)
Cellule di insetto (Baculovirus)
Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.)
Animali transgenici
Piante transgeniche
PROTEINE DI FUSIONE
Per evitare degradazione di proteine eterologhe e per permetterne una più semplice
purificazione, queste vengono prodotte come proteine di fusione con una proteina stabile
dell’organismo ospite.
Un TAG è una sequenza proteica
con proprietà che ci permettono
di purificare la proteina
d’interesse
TAG
TAG
DIMENSIONE
LIGANDO
GST
25 kDa
glutatione
MBP
40 kDa
amilosio
FLAG (DYKDDDDK)
8 aa
Anticorpo monoclonale
specifico
His-tag
6-10 aa
Ni2+
β-Lattamasi
GST
PROTEINE DI FUSIONE
GST
PTP
Dominio catalitico PTP1B
NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO
UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI
Forti
– Alta affinità per l’RNA polimerasi
– Legame forte – trascritto ad alta frequenza
– Legame debole- RNA Pol si stacca, no trasc.
Regolabile
– L’espressione può essere controllata dal ricercatore, tramite induttori e
repressori
UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA PROVOCA:
-inibizione funzioni cellula
-perdita energia
-perdita plasmide
Lattosio
IPTG
ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE
DI UNA PROTEINA DI FUSIONE
1. TRASFORMAZIONE DEL VETTORE D’ESPRESSIONE (CODIFICANTE PER LA
PROTEINA DI FUSIONE) IN OSPITE.
2. AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO.
3. INDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.
4. PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.
1. TRASFORMAZIONE
Assunzione di DNA da parte di un organismo
Amp
Gene di interesse
E. Coli
1. TRASFORMAZIONE
2. AMPLIFICAZIONE
12-16 ore
37°C
2-5x109 cellule
(N = N02n)
LB: Lysogeny Broth (Luria Broth)
Tryptone (fonte aminoacidica)
Estratto di lievito (vitamine e elementi in tracce)
NaCl
Unità formanti colonie
plateau
latenza
t
FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano)
FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante
PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che
muoiono
FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono
assorbanza
3. INDUZIONE
0
1
2
ore
DILUIZIONE
1:100
IPTG
2 ore
37°C
4. PURIFICAZIONE
LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA
supernatante
1. Recupero batteri
10’
Pellet (batteri)
4000 rpm
congelamento/scongelamento
Lisozima (1 mg/ml) (agisce sulla membrana esterna)
2. Lisi
Sonicazione (ultrasuoni)
detergenti
3. Recupero componente proteica
Pellet (membrane, DNA)
30’
13000 rpm
Supernatante
(proteine)
AZIONE DEL LISOZIMA
Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in tessuti
animali dotato di attività battericida. Lisa la parete
batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del
legame beta 1,4 tra l’acido N-acetilmuramico (NAM) e la
N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente
principale delpeptidoglicano.
PARETE Gram-
LISOZIMA
Immobilizzazione della proteina di fusione su supporto solido
ESTRATTO
PROTEICO
GLUTATIONE IMMOBILIZZATO
SU BIGLIE DI SEFAROSIO
RIMUOVO IL
SUPERNATANTE
CONTENENTE LE
PROTEINE NON LEGATE
3000 RPM
+ LAVAGGI con PBS
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA
SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
POZZETTI PER CARICAMENTO
TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8
STACKING GEL
ACRILAMIDE 5%
SDS
TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8
SEPARATING GEL
ACRILAMIDE > 5%
SDS
+
stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il
campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni
comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza.
running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni
sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in
quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della
porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di
separare le proteine con una risoluzione maggiore.
COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA
loading buffer
95° C
+
13000
rpm
•L’ELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME
TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO
•L’SDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI
•IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALI
PONTI DISOLFURO
+
CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL
SUPERNATANTE CONTENENTE LA PROTEINA
Loading buffer
50 mM Tris-HCl pH 6.8
2% SDS
10% Glycerol
1% b-Mercaptoethanol
12.5 mM EDTA
0.02 % Bromophenol Blue
RUOLO DELL’SDS NELLA CORSA
LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA
PROTEINA NATIVA
L’SDS LEGA LE PROTEINE IN UN RAPPORTO DI UN ANIONE OGNI 2 aa
PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA
ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA
RAPPORTO CARICA/MASSA SIMILE PER TUTTE LE PROTEINE NEL CAMPIONE
Il trattamento con SDS elimina le differenze di forma, quindi la lunghezza della catena polipeptidica,
che riflette la massa, e’ l’unico determinante della velocita’ di migrazione.
La separazione avviene quindi per differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa carica
per ogni proteina denaturata con SDS rimane costante.
IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA
25 mM Tris HCl pH 8.3
192 mM Glicina
0.1% SDS
Nel buffer a pH 8.3 la glicina
è carica negativamente e comincia
a migrare con una certa velocità
Gly
Gly
ClCl-
Gly
Gly
Cl-
ClCl-
pH 8.3
ClCl-
Arrivata al loading buffer e allo stacking
(entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra
ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Clsono la specie più veloce
pH 6.8
pH 8.8
Cl-
Cl-
Questo fa sì che le proteine
vengano racchiuse in una regione
ad elevata mobilità elettroforetica
EFFETTO STACKING
Gly
PROTEINE
COLORANTE
Cl- Cl-
Cl- Cl
All’inizio del separating gel il pH 8.8 riporta la glicina ad un rapporto carica/massa
maggiore rispetto a quello delle proteine. La glicina supera i polipeptidi, che non
trovandosi più in una regione ad elevata mobilità elettroforetica rallentano notevolmente
e si ritrovano compattati in una linea molto sottile. Ora le proteine si trovano tutte
allo stesso livello.
Nel separating la concentrazione di acrilamide è più alta, e comincia la separazione
del campione in base al peso molecolare.
Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il
colorante lega arginina, istidina e aminoacidi aromatici, rendendo visibili
le proteine su gel in base alla loro quantità.
APPLICAZIONI
1. SI PUO’ SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER ESPERIMENTI DI PULL DOWN
2. SI PUO’ ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI SEFAROSIO
E UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI
3. SI PUO’ SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO