Corso di insegnamento di
Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti
Tecniche elettroforetiche
Lezione n. XXIV-04.06.14
L’ELETTROFORESI
E’ la separazione di molecole cariche in soluzione
Principio
Si basa sulla migrazione differenziale in un campo elettrico in base
al rapporto carica/massa ed alla forma.
Molte molecole biologiche (amminoacidi, peptidi, proteine,
DNA, RNA) hanno gruppi ionizzabili e pertanto ad un
determinato pH esistono in soluzione come specie cariche
elettricamente, cationi (+) e anioni (-) che, sotto l’azione di un
campo elettrico migrano al catodo o all’anodo.
APPARECCHIATURA
ALIMENTATORE
L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi
applicati alla cella elettroforetica.
I cationi migrano verso il catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+) a una
velocità che dipende dall'equilibrio tra la forza di spinta del campo elettrico
e le forze frenanti (frizionali ed elettrostatiche) esistenti tra ioni e mezzo
circostante.
La corrente è mantenuta lungo il circuito dall'elettrolisi che ha luogo agli
elettrodi, entrambi i quali pescano in capaci recipienti contenenti il
tampone. Durante l'elettrolisi, al catodo si producono ioni ossidrile e
idrogeno, mentre all'anodo si producono ioni idrogeno e ossigeno.
al catodo (-):
2e-+ 2H2O 2OH- + H2
all'anodo (+):
H2O 2H+ +½ O2 + 2e-
CELLE ELETTROFORETICHE
GEL
ORIZZONTALE
GEL
VERTICALE
Corsa elettroforetica
Bisogna mantenere il contatto elettrico tra il gel e il tampone nella camera.
Questo nell'elettroforesi orizzontale può essere
fatto con ponti costituiti da carta da filtro o garza
(a meno che il supporto del campione non sia già la
carta).
In alternativa, in un sistema verticale, si immerge
direttamente il gel nel tampone in modo da
permettere direttamente il passaggio di corrente
attraverso il gel.
I fattori in gioco
1. Il tampone
2. Il campione
3. La concentrazione
4. Il pH
Il tampone
Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo,
mantenendo costante lo stato di ionizzazione delle
molecole da separare.
I tamponi di uso comune sono il formiato, l'acetato, il
citrato, il barbitone, il fosfato, il Tris, l'EDTA, la
piridina.
Il tampone non deve legarsi ai composti da separare,
perché ne altererebbe la velocità di migrazione.
Il campione
m= k c/M
La velocità di migrazione aumenta all'aumentare della carica
netta del campione.
La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del peso
molecolare e questo perché aumentano le forze frizionali ed
elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.
Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad esempio
proteine fibrose e proteine globulari) mostrano differenti
caratteristiche di migrazione a causa del diverso effetto delle
forze frizionali ed elettrostatiche.
La concentrazione del tampone
All'aumentare della forza ionica del tampone la quota di corrente
trasportata dal tampone aumenta mentre diminuisce la quota di
corrente trasportata dal campione che abbassa, così, la sua velocità
di migrazione.
Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal
tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata
dal campione che incrementa, così, la sua velocità dì migrazione.
Perciò la scelta della forza ionica dovrà, in sostanza, rappresentare
un compromesso tra questi due estremi: essa è normalmente
corrispondente a quella di tamponi tra 0,05 e 0,10 M.
Il pH
La dissociazione degli acidi organici aumenta
all'aumentare del pH, mentre il contrario accade per le
basi organiche.
Per composti come gli amminoacidi, che hanno
proprietà sia acide sia basiche (anfoliti) si avranno
entrambi gli effetti del pH:
Pertanto, sia la direzione sia la velocità di migrazione
degli anfoliti dipendono dal pH.
MATERIALI DI SUPPORTO
L'elettroforesi può essere condotta in soluzione libera, senza supporto, nel qual
caso si osserva una resistenza frizionale molto piccola tra ioni e soluzione e
quindi un'elevata velocità di migrazione, (= elettroforesi a flusso continuo)
oppure con un supporto inerte e omogeneo (= elettroforesi a fronte mobile).
Quando l'elettroforesi è condotta su un supporto, i componenti del campione
migrano come bande o "zone" distinte che, al termine della corsa, possono
essere rivelate mediante opportune tecniche analitiche. Questo metodo
prende, quindi, anche il nome di elettroforesi zonale.
I supporti comunemente usati
per l'elettroforesi sono:
• Cellulosa
• Acetato di cellulosa
• Silice (gel)
• Amido (gel)
• Agarosio (gel)
• Poliacrilamide (gel)
• Sephadex (gel)
I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in
polvere quali amido, agar, acrilamide.
GEL DI POLIACRILAMMIDE
Vengono preparati al momento dell'uso facendo copolimerizzare monomeri di acrilamide
con un agente in grado di stabilire legami crociati, solitamente N,N'-metilenbisacrilamide, in
presenza di un catalizzatore e di un iniziatore.
L'iniziatore è persolfato d'ammonio;
Il catalizzatore è una base adatta, N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED)
AMMONIUM
PERSULPHATE
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato, che porta alla produzione di
radicali liberi ( S2O82- + e-  2SO42-) che, a contatto con l'acrilamide reagiscono.
Si formano così lunghe catene di acrilammide
una soluzione di queste catene, sebbene viscosa, non forma però un gel.
La formazione del gel si ha con l'ottenimento di legami crociati tra le catene
Questo si fa portando avanti la polimerizzazione in presenza di N,N'metilenbisacrilamide (può essere pensato come due molecole di acrilamide
accoppiate testa a testa alle loro estremità non reattive
Aumentando la concentrazione del catalizzatore, aumenta la velocità di polimerizzazione del
gel.
E' necessario degasare preliminarmente le soluzioni impiegate, poiché l'ossigeno molecolare
inibisce la polimerizzazione chimica.
La porosità del gel dipende dalla concentrazione di acrilamide e bisacrilamide.
I gel possono essere definiti in termini di percentuale di
acrilamide presente e quelli normalmente usati contengono
dal 3 al 30% di acrilamide, a cui corrispondono rispettivamente
porosità di 2 e 0,5 nm. In generale, un gel al 30% viene
impiegato per separare composti di peso molecolare intorno a
104 dalton, mentre un gel al 3% viene usato per separare
composti di peso molecolare intorno a 10 6 dalton.
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
Vantaggi dell’impiego di gel
1. elasticità
2. buona conducibilità dovuta ad un elevato
contenuto di tampone
3. diametro dei pori estremamente variabile e
riproducibile
4. miscelando opportunamente due soluzioni a
diversa percentuale di T si possono ottenere gel
a porosità crescente per una migliore
risoluzione in un intervallo di pesi molecolari
scelti.
5. potere adsorbente quasi nullo
6. ottima la colorazione
GEL DISCONTINUI
"upper gel" o "stacking gel" - « lower gel" o "running gel
L’upper gel (gel di impaccamento) ha il compito di concentrare il campione di
proteine in una sottile banda, prima che entri nel gel di separazione.
Permettere che le proteine del campione comincino la corsa effettiva nel running
gel in bande molto compatte aumentandola risoluzione della tecnica.
percentuale più bassa di acrilamide  pori di dimensioni molto grandi
Elettroforesi su gel di poliacrilammide
in presenza di sodio dodecilsolfato
SDS-PAGE
Sample buffer
•SDS si lega alle proteine e le denatura (la carica nativa
della proteina è mascherata dalle molecole di SDS
cariche negativamente)
•2-mercaptoetanolo/ DTT riducono i ponti disolfurici
•glicerolo al 10-15% aumenta la densità della
soluzione
•blu di bromofenolo agevola l'osservazione dei
campioni caricati permette di seguirne la migrazione
elettroforetica
La velocità di migrazione diminuisce all’aumentare della
massa
I complessi SDS-proteina, carichi negativamente, si
muovono tutti con la stessa mobilità, la separazione
avviene in base agli effetti del setaccio molecolare dovuti
alle dimensini dei pori del gel
q V q
v E  
f d f
Marcatori di Mr e
calcolo della massa delle proteine
x
y
Rf = x/y
La Mr di una proteina può essere determinata
confrontando la sua mobilità con quella di una serie di
proteine aventi Mr nota (standard), che vengono separate
sullo stesso gel. Si riporta in grafico la distanza percorsa da
ciascuna delle proteine standard, in funzione del logaritmo
in base 10 del suo Mr, costruendo una curva di
calibrazione. Si misura quindi la distanza di migrazione
della proteina avente Mr incognita e per interpolazione si
ottiene il valore di Mr cercato
Rivelazione
-Si sfrutta l'assorbimento e o la fluorescenza nell'ultravioletto.
-Per un'analisi nel visibile si ricorre a una colorazione preventiva.
Coomassie Blue (50-100 ng)
Silver Nitrate (1-2 ng)
-Per gli enzimi è possibile sfruttare l’attività per ottenere prodotti colorati insolubili.
-Se invece il composto è radioattivo si procederà con l'autoradiografia.
ELETTROFORESI
BIDIMENSIONALE
2D-PAGE
2D-PAGE
Estrazione
Prima Dimensione
Seconda Dimensione
Analisi di immagine
Escissione
I DIMENSIONE
ISOELETTROFOCALIZZAZIONE (IEF) in condizioni denaturanti (Urea, Detergenti non
ionici, agenti riducenti) su supporti di gel di poliacrilammide contenenti un gradiente di
pH: separazione in base al punto isoelettrico
+
7,2
3,9
8,8
8,8
7,2
3,9
5,3
7,2
3,9
pH 10
pH 3
7,2
3,9
3,9 ,9
5,3
7,2
7,2
8,8
8,8
II DIMENSIONE
SDS-PAGE: separazione in base al peso molecolare
pH 3
I dimensione
pH 10
T1
T2
+
T3
+
II dimensione
-
.
Esempio di elettroforesi bidimensionale ad elevata risoluzione
E. coli 2-D map
Lisato totale
I dimensione: strip 18cm
pH 3 - 10 NL
II dimensione: gel di
poliacrilammide
con
gradiente 9 – 16 %T
colorato con Nitrato
d‘argento.
www.expasy.org
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Procedura ideale:
Solubilizzazione completa, denaturazione e riduzione di TUTTE le proteine del
campione.
•
•
•
•
Metodi
Lisi (cellule, tessuti, organi…)
– sonicatore, omogeneizzatore, mortaio, pressa, ecc.
Solubilizzazione e denaturazione
– detergenti (non-ionici, zwitterionici)
– Agenti caotropici (denaturanti)
Riduzione
– Agenti riducenti
Se necessario
– Rimozione di sostanze interferenti
– Pre-frazionamento (step di purificazione)
UREA
L’urea è l’agente denaturante più utilizzato, in casi specifici con problemi di
solubilizzazione si può utilizzare la tiourea. Normalmente si utilizza urea
8M, ma anche miscele di tiourea 2M e urea 5-8M.
DETERGENTI
I detergenti vengono aggiunti per rompere interazioni
idrofobiche e incrementare la solubilità proteica. I detergenti
devono essere non ionici o zwitterionici.
Di solito il CHAPS
AGENTI RIDUCENTI
ANFOLITI
Necessari per rompere i ponti disolfurici S-S e
mantenere in forma ridotta le proteina.
Si utilizzano o ditiotreitolo (DTT) o tributil-fosfina
(TBP).
Per ogni range di pH  una miscela di anfoliti carrier che
aumentano la solubilità del campione e generano una
conduttività più uniforme attraverso il gradiente di pH
durante l’ IEF
Prima dimensione: IEF
Il punto Isoelettrico di una proteina
pH<pI
pH=pI
•
Le proteine sono molecole
anfipatiche dotate di gruppi
acidi e basici.
•
Ogni proteina ha un
particolare punto
isoelettrico.
pH>pI
• La carica netta della proteina
dipende dal pH dell‘ambiente
in cui essa si trova.
•
Quando il pH è uguale al pI
della proteina, la carica netta
diventa ZERO.
IEF: principi della separazione
Anodo
pH basso:
Anodo
Le proteine vengono protonate
 Carica positiva
4
IPG strip
Proteine
acide
5
6
7
8
Campo elettrico
Quando le proteine
raggiungono il valore
di pH corrispondente al
proprio pI, la loro
carica netta diviene
zero ed esse
“focalizzano” come
bande discrete
Le proteine cariche
migrano all’interno
del gradiente di pH
9
10
pH alto:
Le proteine vengono deprotonate
 carica negativa
Catodo
Proteine
basiche
Catodo
GRADIENTI di pH IMMOBILIZZATI
Il gradiente di pH: viene creato con set di tamponi derivati dall’acrilammide.
è copolimerizzazto entro le fibre della matrice di poliacrilammide
CH2
CH
C
N
O
H
R
R= -COOH oppure –N(CH3)2
IMMOBILINE
La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione
permette di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel. Una volta integrate nel
gel, le immobiline conferiscono una capacità tamponante controllata e una bassa conduttività
all'interno del gradiente
VANTAGGI del gradiente immobilizzato
 possibilità di reperire in commercio gel preformati  minimizza variazioni
dovute alla preparazione dei gel;
 i gel vengono preparati su una pellicola di plastica che ne facilita l’utilizzo;
 i gradienti di pH sono stabili nel tempo e non subiscono alterazioni dovute alla
presenza del campione stesso
 I gradienti sono praticamente continui e possono essere costruiti secondo diverse
esigenze: lineari/non lineari; ampi (ad esempio pH 3-10)/molto ristretti ( pH 4-5)
Gradiente lineare e non lineare
Usando gradienti di pH stretti (1 unità) la risoluzione aumenta e i gel possono anche
tollerare carichi proteici maggiori
Innovazione!!
Immobilized pH Gradient strip = IPG strip
 Sottili strisce di gel di poliacrilamide al 5% T
polimerizzato su un supporto di plastica
 Utilizzano gradienti di pH immobilizzati
 Acquistate in commercio oppure
prodotte direttamente in laboratorio
Disponibili in differenti lunghezze
e range di pH (7, 11, 13, e 18 e 24 cm)
 Disidratate  Devono essere reidratate prima dell’ IEF
Volumi calcolati di liquido da applicare per la reidratazione
occorre rispettare i limiti di volume e quantità di proteina
caratteristici del tipo di strip che si sta utilizzando
Volumi maggiori  entrata prefereneziale di molecole a basso peso molecolare
(prima acqua poi altri ioni e per ultime proteine ad alto PM).
Volumi minori  il gel non si rigonfia alle opportune dimensioni. Le
dimensioni dei pori della matrice non sono controllati e pari a quello che
dovrebbero essere Questo porta ad una difficolta nell’analizzare proteine ad
alto PM.
REDRATAZIONE DELLE STRIP
 Le IPG strips sono reidratate over night nel Immobiline DryStrip Reswelling Tray
 La soluzione di reidratazione è applicata alle scanalature del supporto
 In ciascuna scanalatura viene posta una strip
 Ogni strip viene coperta con il IPG Cover Fluid (olio di paraffina) per minimizzare
l’evaporazione e la cristallizzazione dell’urea e per evitare il contatto con la CO2 che se
adsorbita dal gel può provocare un’acidificazione della matrice con conseguente errata
lettura dei punti isoelettrici
Immobiline DryStrip reswelling tray
Rehydration loading
CARICAMENTO DEL CAMPIONE
Il campione viene diluito nella soluzione di reidratazione
(tutti i campioni devono essere normalizzati: stessa
quantità di campione) e pre-adsorbito sulle strip durante
la loro reidratazione.
Cup loading
Il gel viene reidratato seguendo una procedura analoga
a quella utilizzata per il caricamento a reidratazione,
con la sola differenza che non c’è campione proteico
durante tale fase. Al termine della reidratazione, il gel
viene collocato capovolto (gel verso l’alto) in
un’apposita vaschetta. Sul gel, in una determinata
posizione (a seconda che sia un caricamento anodico o
catodico) viene collocata un apposito applicatore
dentro il quale viene caricato il campione. La corsa di
isoelettrofocalizzazione in questo caso viene effettuata
sempre a testa in sù.
Cup loading
Ettan IPGphor Manifold
Rehydration loading
strip holder
Ettan IPGPhor (Amersham Bioscience)
Si pipetta il campione in entrambi i pozzetti laterali dello
strip holder
Isolelettrofocalizzazione
Non esiste un protocollo di isolelettrofocalizzazione universale  ogni singolo passo
deve/può essere ottimizzato in funzione del campione in indagine.
regole generali :
 Il voltaggio può essere aumentato sia in modo lineare (ramping) sia in modo brusco
(step and hold)
Temperatura: mantenuta attorno ai 20 °C:
più bassa l’urea cristallizza,
più alta (>37 °C) l’urea modifica le proteine.
Voltaggi vengono aumentati progressivamente (secondo particolari protocolli) per fare in
modo che nelle prime fasi della IEF gli ioni presenti nel campione (ioni presenti nel campione, lysis
buffer o controioni dei gruppi acidi o basici del gel) vengano trasportati al di fuori del gel
Migrazione in campo elettrico
Es.: per le strip da 7 cm pH 3-10 lineare
Step 1: 500 V, 0:01 h
Step 2: 4000 V, 1:30 h
Step 3: 5000 V, 0:45 h
50 uA per strip
In totale ~7.1 kVh, 2:16 h
Temperatura costante 20 °C
Multiphor II
IPGphor
Passaggio dalla I alla II dimensione
La transizione dalla prima alla seconda dimensione coinvolge
l’equilibrazione della striscia focalizzata in tampone contenente
SDS e la riduzione e alchilazione dei pondi disolfurici mediante
l’uso di DDT (ditiotreitolo) e IAM (iodoacetamide) per bloccare
in modo covalente i gruppi SH delle proteine, prevenendo la
formazione di ponti disolfurici durante la seconda dimensione.
H+
TBP
H2O
or
DTT - DTE
NH2
O
SH
=
I
S-S
H
TBP+ O-
S- -S
TBP =O
HI
S NH2
O
=
S-S
2 H+
Step di Equilibrio
•
•
•
Tampone di Equilibrio (Tris-HCl 50 mM pH 8.4)
mantiene il pH della strip nel range appropriato per l‘elettroforesi.
Urea (6 M)
Riduce gli effetti dell‘elettroendosmosi aumentando la viscosità del tampone.
L‘elettroendosmosi (EEO) è dovuta alla presenza di cariche negative fissate sulla IPG
strip.
EEO causa un flusso di acqua che ostacola la migrazione delle proteine e può
interferire con il trasferimento delle stesse dalla strip al gel della seconda dimensione
Glycerol (30 %)
Riduce gli effetti dell‘elettroendosmosi e facilita il trasferimento delle proteine dalla strip al gel
per la seconda dimensione.
•
SDS (2 %)
Denatura le proteine e le carica negativamente.
•
Step 1: Ditiotreitolo (DTT) (2 %)
15 minuti
Riduce i ponti disolfuro preservando lo stato denaturato delle proteine.
•
Step 2: Iodoacetammide (IAA) (2.5 %)
10 minuti
Alchila i gruppi tiolici delle proteine prevenendo la riossidazione dei ponti disolfuro durante
l‘elettroforesi.
Blu di Bromofenolo (BFB) (tracce)
Colorante – consente di seguire l‘andamento della migrazione.
II Dimensione: SDS-PAGE
Principi della separazione
SDS-PAGE „classica“
2D-PAGE
L’SDS riveste le proteine
La miscela di proteine viene caricata sul gel e
fatta migrare in campo elettrico
Separazione delle
proteine in base
al peso molecolare
Gel di
poliacrilammide
Direzione della migrazione
Visualizzazione delle bande
Proteiche mediante colorazione
Lo stacking gel è costituito dalla IPG strip.
La IPG strip viene fissata con Agarosio 0.5%
STEP DI EQUILIBRIO (tra la I e la II dim)
Riduzione/Alchilazione in una soluzione contenente SDS
II Dimensione: SDS-PAGE
Trasferimento della strip equilibrata sul gel
SDS-PAGE
ETTAN Daltsix
MINI PROTEAN
.
Esempio di elettroforesi bidimensionale ad elevata risoluzione
E. coli 2-D map
Lisato totale
I dimensione: strip 18cm pH
3 - 10 NL
II dimensione: gel di
poliacrilammide
con
gradiente 9 – 16 %T colorato
con Nitrato d‘argento.
www.expasy.org
VISUALIZZAZIONE
Una volta separato il campione in elettroforesi si procede alla colorazione del gel
 La scelta della colorazione dipenderà soprattutto dalla quantità di proteine
caricate.
 Le colorazioni non devono interferire con i processi successivi
sensibilità
• Nitrato di Argento  fino a 0,1 ng
• Commassie Brilliant Blue (CBB) Colloidale G-250: circa 5 – 10 ng)
• Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 : circa 100-50 ng
•coloranti fluorescenti
•SYPRO Ruby (Molecular Pobes) o
• il Deep Purple (GE Ealthcare
Grazie al suo elevato potere risolutivo, l'elettroforesi bidimensionale è una
tecnica che permette la separazione contemporanea, su di un unico gel, sia dei
prodotti genici primari sia delle modificazioni successive eventualmente
presenti .
Utilizzando l'elettroforesi 2D, dove ogni macchia proteica ha una posizione
univoca determinata dal peso molecolare e dal punto isoelettrico, si può
studiare come al variare delle condizioni sperimentali, cambi qualitativamente
(presenza/assenza) e/o quantitativamente (intensità) l'espressione di gruppi o
singole proteine, così come possono essere studiate le modificazioni posttraduzionali (fosforilazioni, glicosilazioni, ossidazioni, etc.) che coinvolgono
singoli componenti o gruppi di proteine.
Una proteina che esiste in forma mono-, bi-, e trifosforilata può apparire
come una singola banda su un gel in SDS monodimensionale (La presenza di
uno o due gruppi fosfato in più non ha un effetto significativo sulla massa
molecolare relativa totale della proteina) ma può generare più bande su un gel
bidimensionale (la piccola differenza di carica introdotta su ogni molecola può
essere invece rilevata dall’IEF)
APPLICAZIONI
 Confrontare tessuti normali con tessuti malati e/o trattati
 Analizzare l’effetto del trattamento, con farmaci o tossine, sulle
cellule
 Osservare i cambiamenti della componente proteica della cellula
a stadi diversi dello sviluppo del tessuto
 Osservare la risposta a stimoli extracellulari
 Confrontare ceppi batterici patogenici e non patogenici
 Confrontare i profili proteici del siero di individui sani con quelli
malati (es. Alzheimer, tumori) per identificare proteine,
prodotte nel siero dei pazienti, che possano essere utilizzate
come indicatori diagnostici per le malattie
 Evidenziare l’eventuale presenza di glicosilazioni, fosforilazioni o
processamenti proteici