Spettroscopia di fluorescenza
con luce polarizzata
Richiami
Luce polarizzata linearmente (o piana):
il vettore campo elettrico è orientato lungo una direzione fissa,
ortogonale alla direzione di propagazione. Il suo modulo
oscilla sinusoidalmente.
 
z 
E(z,t)  i E 0 cos2 t  
 
 
z
x
y
Richiami
Dipolo di transizione:
01  1er 0
Per analogia classica si può definire come lo “spostamento” di carica
causato dalla transizione elettronica.
Si dimostra che, in prima approssimazione, la probabilità per unità di tempo
di una transizione elettronica è proporzionale a
01
2
nel caso di eccitazione con luce non polarizzata, ed a
eˆ  01 
2
per luce polarizzata linearmente (e =direzione della polarizzazione della
luce).
Fotoselezione
Eccitando un campione con luce polarizzata linearmente si
portano nello stato eccitato prevalentemente le molecole con il
dipolo di transizione (per l’assorbimento) orientato
parallelamente alla direzione di polarizzazione.
cos
2
()
1
0.5
0
-90
0
90
Diffusione
I movimenti diffusivi rendono casuali le orientazioni delle
molecole eccitate.
Anisotropia dell’emissione
Misurando la polarizzazione della luce emessa si determina la
rapidità dei movimenti diffusivi (rispetto al tempo di vita di
fluorescenza).
I|| (t)  I  (t) I|| (t)  I  (t)
r(t) 

I|| (t)  2I  (t)
ITot. (t)
Eccitazione
I||
I
Emissione
Campioni rigidi (anisotropia limite)
Se A è parallelo a E :
2
r  r0 
5
Altrimenti:
ˆ A (0)  
ˆ E (0) 1
2 3
3cos2  1
r  r0 
 0.4
5
2
2
2
0.2  r0  0.4
L’anistropia limite è una proprietà del
fluoroforo (e dipende dalla lunghezza
d’onda di eccitazione).
Diffusione e decadimento dell’anisotropia
ˆ A (0)  
ˆ E (t) 1
3 
ˆ E (0) 
ˆ E (t) 1
2 3 
r(t) 
 r0
5
2
2
2
2
Diffusione libera ed isotropa (sfera rigida):
r(t)  r0e

t


1
2
f   cos 1 cos 
2

Anisotropy
Diffusione limitata all’interno di un cono:
t




r(t)  r0 (1 f ) e  f 




V
kT
0.4
0.3
Overall tumbling
0.2
Local motions
0.1
Overall + local motions

0
0
1
2
3
Time [ns]
4
5
Anisotropia statica
Un’eccitazione continua può essere
pensata come sovrapposizione di
tanti impulsi di luce uno dopo
l’altro.

 r(t)I(t)dt
r 0 
 I(t)dt
Time
0
Nel caso più semplice:
I(t)  I 0e

t

r(t)  I 0e

t

r
r0

1

Applicazioni
•Dinamica di macromolecole
•Transizioni conformazionali
•Processi di associazione
0.18
0.16
0.14
r
0.12
0.1
0.08
10 -7
WT
Mutant
10 -6
[XL-SOD] (M)
•Misure di microviscosità.
10 -5
Distorsioni strumentali: il parametro G
• Il fluorimetro (in particolare i monocromatori) sono
diversamente sensibili alle due polarizzazioni.
• Per correggere questo effetto si effettuano misure anche con il
polarizzatore di eccitazione disposto orizzontalmente.
• In assenza di effetti strumentali Iov ed Ioo dovrebbero essere
uguali (entrambi sono I)
Eccitazione
I ov
I oo
I vv  I vo G
r
I vv  2I vo G
G
Iov
Ioo Emissione
2a esperienza:
transizioni di fase in doppi strati lipidici
I fosfolipidi:
1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina
O
Pallmitoil Oleoil fosfatidilcolina (POPC)
O
H3C (CH2)7
H3C (CH2)14 C
H H
C C (CH2)7 C
O
O
CH2
O
C
H
O
CH2 O
P
O-
O
CH3
CH2 CH2 N+ CH3
CH3
Doppi strati lipidici e liposomi
Transizione di fase gel-cristallo liquido