Spettroscopia CD
 Luce polarizzata
 Polarimetro
 Sostanze Chirali
 Molecola Otticamente attive
 Birifrangenza
 Dicroismo Circolare
Radiazione Elettromagnetica
Modello classico ad onda sinusoidale
La radiazione elettromagnetica è
composta da onde elettromagnetiche,
consistenti, cioè, nell'oscillazione
concertata di un campo elettrico e di un
campo magnetico. Queste onde si
propagano in direzione ortogonale a
quella di oscillazione
Luce emessa da
una lampadina
Luce monocromatica
Laser
Polarizzazione
Rispetto a un'onda acustica o a un'onda marina,
elettromagnetica presenta un'ulteriore caratteristica:
l'onda
la polarizzazione.
Il vettore campo elettrico (così come il vettore campo magnetico) di
un'onda oscilla sempre nella stessa direzione.
Il piano individuato dalla
direzione di oscillazione del campo
elettrico e dalla direzione di propagazione
dell’onda è il suo
piano di
polarizzazione.
Polarizzazione
•Il vettore campo elettrico E mantiene costante la sua direzione
(perpendicolare alla direzione di propagazione).
•L’ampiezza del vettore E varia in modo sinusoidale (nel tempo
e lungo la direzione di propagazione).
Convenzionalmente la direzione del vettore E è rappresentata con un
segmento con doppia freccia
Radiazione non polarizzata
Le sorgenti più comuni (sole, lampadine)
emettono onde in cui il piano di
polarizzazione è orientato in modo casuale
attorno alla direzione di propagazione: la
radiazione è non polarizzata.
Polarizzazione Lineare
Se tutte le onde che costituiscono la
radiazione hanno la stessa direzione di
oscillazione del campo elettrico (stesso piano di
polarizzazione), la radiazione è polarizzata
linearmente.
Polarizzazione Lineare
Polarizzazione lineare
lungo l’asse y
Polarizzazione lineare
lungo l’asse x
In queste e nelle successive
animazioni viene mostrato il solo
campo
elettrico;
il
campo
magnetico è perpendicolare a
quello elettrico e alla direzione di
propagazione dell’onda
Polarizzatore
Polarizzatore
Per spiegare come avviene la polarizzazione della luce si può
fare il seguente esempio del cancello e grata metallica.
scuotendo la corda per creare un’onda questa attraversa il cancello solo
se l’onda giace su un piano parallelo alle inferriate del cancello.
Per spiegare il fenomeno considerando la luce come un insieme di raggi rettilinei, ho proposto di
pensare ai raggi della luce come ad un mazzo di spaghetti sparpagliati: se si lasciano cadere gli
spaghetti sopra una rete a cavi paralleli, questa sarà attraversata solo dagli spaghetti che sono
paralleli ai cavi
Polarizzatore
Per spiegare come avviene la polarizzazione della luce si può
fare il seguente esempio del cancello e grata metallica.
Polarizzatore
Polarizzatore
La radiazione non polarizzata può essere resa polarizzata
facendola passare attraverso un polarizzatore che lascia passare
solo le componenti del campo elettrico che sono parallele
all’asse del polarizzatore
PolarizzatoreI filtri Polaroid sono materiali
plastici costituiti da molecole
allungate, allineate mediante
stiramento
Se la luce è polarizzata
perpendicolarmente alla direzione
della molecola, essa viene
totalmente trasmessa
Per qualsiasi altra direzione di
polarizzazione la luce è trasmessa,
ma con intensità minore rispetto
alla luce incidente.
Se la luce è polarizzata
parallelamente alla direzione della
molecola, essa viene totalmente
assorbita dalla molecola.
Polarizzatore
Sovrapponendo due filtri
polarizzatori e facendoli ruotare
l'uno rispetto all'altro si osserva
un graduale oscuramento.
Polarizzatore
una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA
se è in grado di ruotare il piano della luce
polarizzata
affinché la sostanza sia otticamente attiva, le
sue molecole devono presentare una
asimmetria nella loro struttura, tale da
ruotare il piano di polarizzazione della luce.
In particolare le sostanze otticamente attive
sono connesse ad una determinata proprietà
delle molecole: la chiralità
es. aminoacidi
una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA
se è in grado di ruotare il piano della luce
polarizzata
polarimetro
Quando un fascio di luce monocromatica linearmente polarizzata attraversa un
campione di sostanza chirale, il piano di polarizzazione della luce uscente dal
campione forma un angolo con quello della radiazione incidente. Tale angolo,
misurato in gradi, (positivo o negativo a seconda che la rotazione sia avvenuta in
senso orario, a destra, o in senso antiorario, a sinistra, rispetto ad un osservatore
verso cui si propaga l'onda) viene detto ROTAZIONE OTTICA. Esso dipende
dallo spessore attraversato e dalla quantità di materia ivi contenuta.
polarimetro
polarimetro
La luce ordinaria (di solito una radiazione monocromatica del sodio)
entra in un prisma polarizzante di Nicol (polarizzatore) e viene
convertita in luce polarizzata, che passa attraverso un tubo contenente
il campione per poi arrivare a un altro prisma di Nicol,
detto analizzatore.
polarimetro
All'interno del tubo portacampioni viene inserita una sostanza che
può fare ruotare il piano della luce polarizzata ed essere
quindi otticamente attiva(es. soluzione di acqua e zucchero,
trementina, soluzioni di carboidrati, proteine e steroidi). Se la sostanza
invece è otticamente inattiva (es. acqua, alcol), il piano della luce
polarizzata resta invariato.
polarimetro
Il prisma analizzatore può ruotare e quando è orientato a 90° rispetto al piano della
luce polarizzata, la luce non passa e il campo visivo dell'osservatore risulterà nero.
Con rotazioni intermedie tra 0° e 90° una certa frazione della luce sarà trasmessa sino
all'occhio dell'osservatore e cioè quella frazione che corrisponde alla componente del
vettore luminoso nel piano dell'analizzatore. Se il prisma analizzatore è orientato a 0°
rispetto al piano della luce polarizzata si ha il massimo valore della luce trasmessa.
Potere Rotatorio Specifico
λ= lunghezza d’onda (riga D del sodio, 598 nm)
T = temperatura in °C
α= angolo di rotazione osservata
c = concentrazione del campione in g/mL
l= lunghezza della cella (dm)
Potere Rotatorio Specifico
Polarizzazione Circolare
l’estremo del vettore E , in un dato punto,
descrive nel tempo una circonferenza.
Si distingue tra polarizzazione circolare
destrorsa o sinistrorsa a seconda che
l’estremo del vettore E, visto da un
osservatore verso cui si propaga l’onda,
descriva nel tempo una
circonferenza in senso orario o antiorario
Polarizzazione Circolare
La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere
composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a
luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale
intensità.
La
combinazione
delle
due
componenti
circolarmente
polarizzate in direzione opposta,
quindi risulta in luce linearmente
polarizzata che oscilla in un piano
perpendicolare alla direzione di
propagazione.
Polarizzazione Circolare
La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere
composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a
luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale
intensità.
La
combinazione
delle
due
componenti
circolarmente
polarizzate in direzione opposta,
quindi risulta in luce linearmente
polarizzata che oscilla in un piano
perpendicolare alla direzione di
propagazione.
Polarizzazione Circolare
La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere
composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a
luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale
intensità
Il vettore campo elettrico non
cambia in modulo durante un
periodo, ma varia in direzione,
sempre restando perpendicolare alla
direzione di propagazione.
La sua proiezione su un piano
perpendicolare alla direzione di
propagazione è una circonferenza.
Nel tempo il vettore descrive perciò
un'elica destrogira o levogira.
una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA
se interagisce in modo diverso con luce polarizzata
circolarmente a destra e a sinistra.
La ROTAZIONE OTTICA deriva da una velocità diversa, e
quindi da un indice di rifrazione diverso, per la propagazione
di luce polarizzata circolarmente a sinistra e a destra
(birifrangenza circolare).
nL≠ nR
Polarizzazione Circolare
Nella regione di lunghezze d’onda in cui il
campione assorbe, la diversa interazione della
sostanza otticamente attiva con luce
polarizzata circolarmente a destra o a sinistra
può esplicarsi in un diverso assorbimento, cioè
due coefficienti di assorbimento diversi per le
due componenti di luce circolarmente
polarizzata (a destra o a sinistra):
eL ≠eR
l'intensità di una delle due componeneti viene
ridotta maggiormente rispetto all'altra.
Il risultato sarà che quando ricombinate, queste due componenti
danno luogo a luce che non è più linearmente polarizzata (figura a),
ma a luce ellitticamente polarizzata (figura b). Questo effetto viene
chiamato Dicroismo Circolare.
Polarizzazione Circolare
eL ≠eR
l’estremo del vettore E, in un dato punto, descrive nel
tempo una ellisse
anche in questo caso si distingue tra polarizzazione ellittica destrorsa o
sinistrorsa a seconda che l’estremo del vettore E, visto da un osservatore verso
cui si propaga l’onda, descriva nel tempo una circonferenza in senso orario o
antiorario
Polarizzazione Circolare
L’animazione che segue mostra cosa accade ad un’onda polarizzata linearmente (celeste)
quando attraversa un mezzo (ipotetico) che non assorbe affatto la componente circolare
sinistra (in rosso), ma assorbe molto la componente destra (in verde)
All’ingresso
del mezzo
All’uscita del
mezzo
Polarizzazione
Spettropolarimetro CD
La radiazione monocromatica viene polarizzata linearmente e passa poi
attraverso un modulatore fotoelastico che genera alternativamente luce
polarizzata circolarmente a sinistra e a destra con una certa frequenza di
modulazione.
La radiazione così modulata passa attraverso il campione e rivelata dal
fotomoltiplicatore. Il segnale risultante, anch’esso modulato alla stessa
frequenza, fornisce la differenza di assorbanza delle due componenti
polarizzate circolarmente, a quella lunghezza d’onda. Variando la lunghezza
d’onda si ottiene lo spettro CD.
Il dicroismo circolare ha luogo solo nelle regioni dello spettro in
cui il campione assorbe
La birifrangenza circolare ha luogo in tutte le regioni di lunghezze
d’onda di una sostanza otticamente attiva.
Le regioni di frequenze esplorate per CD possono essere diverse,
tuttavia il caso più comune è quello dell’UV–visibile (transizioni
elettroniche).
Uno spettro CD, come quello di assorbimento isotropo, risulta
costituito quindi da bande. Una banda CD, ben separata dalle altre,
assomiglia strettamente alla corrispondente banda isotropa, ma,
diversamente da questa, poiché si tratta di una differenza di
assorbimento, può essere sia positiva sia negativa (a seconda che eL
sia maggiore o minore di eR).
Applicazioni CD in biologia
•
•
•
•
•
Folding/unfolding di proteine
Ligand binding (costanti di legame)
Variazioni strutturali indotte per es da pH, solvente, temperatura
Aspetti strutturali di acidi nucleici,polisaccaridi, ormoni, peptidi
Termodinamica degli acidi nucleici
Applicazioni CD in biologia
CD di acidi nucleici
I cromofori responsabili dell’assorbimento nel vicino UV
sono le basi puriniche e pirimidiniche.
Le basi stesse sono intrinsecamente simmetriche,
e quindi otticamente inattive.
Nei nucleotidi, tuttavia, esse acquisiscono una assimmetria
configurazionale indotta dagli zuccheri chirali ribosio e
desossiribosio, a cui sono legate, che rende le bande
dicroiche.
CD di acidi nucleici
DNA: una banda positiva a circa 275 nm e una
negativa a 240 nm.
Le bande sono molto più intense di quelle della
miscela di monomeri alla stessa composizione.
RNA: una banda positiva a circa 260 nm ed
una banda negativa a 210 nm.
Si può osservare nettamente che
il contributo fondamentale, in entrambi i polimeri, è
dovuto principalmente dalla struttura secondaria,
che determina interazioni particolari tra i cromofori.
Gli spettri CD sono quindi un metodo molto
sensibile alla struttura secondaria di queste
macromolecole, e alle sue variazioni con
solvente, temperatura, forza ionica, …
CD di acidi nucleici
Lo scheletro lineare del DNA si avvolge su se stesso per formare
una struttura elicoidale destrorsa o sinistrorsa.
Si distinguono, essenzialmente,
due forme di DNA destrorso, denominate forma A e forma B,
e una forma sinistrorsa, detta Z
Le maggiori differenze consistono nella geometria dei legami,
nel numero di basi necessarie per un giro d’elica, per l’angolo di
inclinazione di zuccheri e basi rispetto all’asse.
La forma A invece si
presenta
come
un
filamento corto e spesso
con diametro di 25.5 ˚A,
in cui le basi sono
inclinate di circa 19o
rispetto all’asse principale
e giacciono su un piano
ruotato di circa 30o
rispetto
al
piano
ortogonale all’asse stesso.
La forma B `e quella maggiormente favorita in
condizioni di alta umidità relativa (maggiore del 75%), e
quindi la forma predominante in soluzioni acquose.
La forma Z del DNA invece, ha avvolgimento sinistrorso
dovuto a una diversa disposizione relativa di zucchero e
basi azotate nello spazio: la struttura che la caratterizza ha
un aspetto esteriore ben diverso dalle eliche destrorse
poichè l’ossatura fosforo-zucchero si snoda a zig-zag lungo
l’asse principale e proprio per tale motivo viene denominata
Z.
CD di acidi nucleici
forma B (…) : un doppietto positivo –
negativo a circa 280 e 240 nm e una
intensa banda positiva a 190 nm.
A
B
Z
forma A (- - -) : una banda positiva a 270
nm, più intensa delle forme precedenti,
accoppiata ad una banda negativa a 210
nm e a quella positiva, estremamente
intensa, a 185 nm.
forma Z (-) (elica sinistrorsa): una banda negativa a 290 e una positiva a 260
(cioè un doppietto di segno opposto a quello della forma B), una banda
negativa a 195 nm ed una ancora più intensa positiva a 180 nm. La proposta
originaria è stata poi dimostrata dall’analisi strutturale ai raggi i X.
CD di acidi nucleici:
interazione con piccole molecole
CD di Proteine
CD di Proteine
(ca 200-250 nm)
Gli aminoacidi sono asimmetrici e
sono sempre otticamente attivi
La struttura SECONDARIA di una proteina
può essere determinata mediante
spettroscopia CD nella regione
dell’UV-lontano (190-250 nm).
Questa regione è dominata
dall’assorbimento del legame petidico
Spettro CD della poli-lisina
CD di Proteine
(ca 200-250 nm)
CD di Proteine
(UV lontano)
Lo spettro CD di una proteina nel lontano UV
può essere sensibile a certi aspetti della
struttura terziaria
A queste lunghezze d’onda i cromofori sono gli amino acidi aromatici e i legami
disolfuro.
I segnali CD nel lontano UV sono circa nulli, se una proteina conserva la sua
struttura secondaria ma non mantiene una struttura terziaria ben definita. Se invece
compaiono dei segnali in questa regione spettrale vi è chiara indicazione che la
proteina possiede una struttura tridimensionale definita.
Lo spettro CD nel lontano UV è anche sensibile a piccole modificazioni della struttura
terziaria dovute ed interazioni proteina-proteina.
Emoglobina
Deossiemoglobina
(alto spin)
Ossiemoglobina
(basso spin)
Emoglobina
Deossiemoglobina
(alto spin)
Ossiemoglobina
(basso spin)
CD di Proteine:
Studio della denaturazione
Le proteine possono essere denaturate in vari modi:
1.variando la temperatura,
2.variando il pH fino a condizioni estreme,
3.utilizzando denaturanti chimici.
Gli organismi termofili sono caratterizzati da una temperatura di crescita
ottimale compresa tra 50 e 80°C
Per gli organismi ipertermofili tale temperatura è compresa tra 80 e 120°C.
L’identificazione dei principi di adattamento delle proteine alle alte
temperature è indispensabile per chiarire il meccanismo del folding e le
relazioni funzione-struttura.
CD di Proteine:
Studio della denaturazione
Lo spettro della proteina nativa a 20°C
mostra una banda negativa con un minimo
profondo tra i 210 e 220 nm e un’intensa
banda positiva tra i 190 e i 195 nm. Queste
caratteristiche sono tipiche di proteine
contenenti molti elementi di struttura
secondaria quali a-eliche e foglietti b.
Lo spettro CD dell’enzima a 108°C mostra
un minimo meno profondo tra i 210 e220 nm,
tuttavia, la struttura della proteina è ancora
parzialmente conservata. Questo mostra che
la SsoPox è una proteina estremamente
resisitente alla tempratura, come è lecito
aspettarsi essendo una proteina proveniente
da un batterio ipertermofilo.
Riassumendo
Da un’analisi CD possiamo ottenere informazioni sulla struttura tridimensionale di
macromolecole otticamente attive come DNA e proteine.
Per farlo si utilizza lo spettropolarimetro, uno strumento in grado di misurare l'ellitticità
generata da un campione al variare della lunghezza d'onda del raggio incidente (siamo nel
campo degli UV), ottenendo così lo spettro CD di quel campione.
• Ogni struttura secondaria delle proteine ha un suo spettro caratteristico dovuto alla
disposizione spaziale dei legami peptidici. Confrontando questi spettri con quello di una
proteina qualsiasi è possibile ricavare il tipo di strutture secondarie di quella proteina e in che
misura sono presenti.
•Con la spettroscopia di dicroismo circolare non possiamo sapere quali sono, ad esempio, gli
aminoacidi coinvolti in tali strutture (per queste informazioni bisogna ricorrere alla più
complessa spettroscopia NMR (o EPR) e alla cristallografia con i raggi X) però permette in
modo rapido di ottenere informazioni come la stabilità della struttura di una proteina
al variare della temperatura o dell'intorno chimico in cui si trova.
Il citoctomo b562 è una piccola proteina solubile (12.3 kilodaltons) isolata dalla
Escherichia coli che contiene un gruppo prospettico eme di tipo b.
Al’epoca dell’articolo si ipotizzava che la funzione di questa proteina fosse quella di
trasportare elettroni anche se non di aveva alcune conoscenza dei possibili partners.
Il citoctomo b562 presetza una struttura semplice (quattro eliche impachettate circa
antiparallelamente le une rispetto alle altre con il gruppo eme posizionato ad uan
estremità della struttura) che la rende un buon modello per studiare la stabilità ed il
ripiegamento delle proteine.
Studi sulle apomioglobine, apoemoglobine e apocitocromi avevano all’epoca suggerito
che la stabilità e la struttura di queste proteine dipendesse fortemente dalla presenza
del gruppo eme.
Lo scopo del presente lavoro era stato quello di approfondire le conoscenze sul ruolo del
gruppo eme nella integrità ed il ripiegamento delle proteine
Materiali:
•Ferrocitocromo b562
•Ferricitocromo b562
•Apocitocromo b562
Tecniche sperimentali:
•spettroscopia UV
•Spettroscopia CD
•Cromatografia (HPLC)
•Ferrocitocromo b562
•Ferricitocromo b562
•Apocitocromo b562
Struttura secondaria
•Ferrocitocromo b562
•Ferricitocromo b562
•Apocitocromo b562
Tutti e tre gli spettri mostrano un picco
negativo a 222 nm che indica un alto
contenuto di struttura ad elica .
L’effetto è meno marcato per
l’apoproteina, suggerendo una minore
quantità di struttura ad elica rispetto
alla ferri e ferro proteina
Denaturazione acida
•Ferricitocromo b562
•Apocitocromo b562
pH 2.9
pH 2.3
La denaturazione delle proteine a bassi
pH è dovuta alla repulsione tra cariche
Energia libera di stabilizzazione e stabilità termica
DG = 3.4 kcal/mol apocitocromo
DG = 6.6 kcal/mol ferricitocromo
Tm= 52.3 °C apocitocromo
Tm= 67.2 °C ferricitocromo
La stabilità dell’apoproteina è ridotta dalla’assenza del gruppo eme
I risultati del’analisi cromatografica di esclusione molecolare indicato che
l’apoporoteina presenta una struttura molecolare più estesa del ferricitocromo