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USO delle COLTURE CELLULARI
1. Vantaggi e svantaggi
USO delle COLTURE CELLULARI
1. Vantaggi e svantaggi
2. Inizio di una coltura cellulare
USO delle COLTURE CELLULARI
1. Vantaggi e svantaggi
2. Inizio di una coltura cellulare
3. Struttura del laboratorio
4. Asepsi
CAPPE A FLUSSO LAMINARE
BIOHAZARD CABINET
a.
b.
Classe II
Classe III
CAMERA CALDA
USO delle COLTURE CELLULARI
1. Vantaggi e svantaggi
2. Inizio di una coltura cellulare
3. Struttura del laboratorio
4. Asepsi
5. Caratteristiche dell’ambiente esterno
substrato
fase gassosa
pH e temperatura
terreni e supplementi
6. Mantenimento di una coltura cellulare
sostituzione del terreno
subcultura
ciclo di crescita
CURVA DI CRESCITA di UNA LINEA CELLULARE
USO delle COLTURE CELLULARI
1. Vantaggi e svantaggi
2. Inizio di una coltura cellulare
3. Struttura del laboratorio
4. Asepsi
5. Caratteristiche dell’ambiente esterno
substrato
fase gassosa
pH e temperatura
terreni e supplementi
6. Mantenimento di una coltura cellulare
sostituzione del terreno
subcultura
ciclo di crescita
7. Conservazione
8. Tipi di contaminazione
batteri
lieviti
muffe
micoplasmi
contaminazioni crociate
9. Colture tridimensionali
COLTURE TRIDIMENSIONALI
TECNICHE PER OTTENERLE:
1. Tecnica dell’overlay liquido
COLTURE TRIDIMENSIONALI
TECNICHE PER OTTENERLE:
1.
Tecnica dell’overlay liquido
2.
Metodo delle fiasche rotanti
COLTURE TRIDIMENSIONALI
TECNICHE PER OTTENERLE:
1.
Tecnica dell’overlay liquido
2.
Metodo delle fiasche rotanti
3.
Metodo microwells
COLTURE TRIDIMENSIONALI
TECNICHE PER OTTENERLE:
1.
Tecnica dell’overlay liquido
2.
Metodo delle fiasche rotanti
3.
Metodo microwells
4.
Colture multistrato
MISURE DI VITALITA’ IN SISTEMI
CELLULARI DI MAMMIFERO
TEST
1. PERMEABILITA’
Esclusione/inclusione di coloranti
PARAMETRO MISURATO
Integrità della membrana cellulare
Rilascio di 51Cr e 125I-UDR
Rilascio LDH
2. FUNZIONALI
Livelli di ATP, ADP e AMP
Capacità energetica cellulare
Attività della succinato deidrogenasi
Funzionalità mitocondriale
Sintesi di DNA
Capacità di sintesi di macromolecole
Sintesi proteica
Gradienti ionici e aminoacidici
3. MORFOLOGICI
Mantenimento di pH e forza ionica ottimali
“Blebbing” della membrana
Disorganizzazione della membrana plasmatica
Volume
Citoscheletro
Alterazioni delle proprietà osmotiche cellulari
Alterazioni delle strutture cellulari di supporto
4. RIPRODUTTIVI
Formazione di colonie in vitro
Capacità di divisione cellulare infinita
Formazione di colonie in vivo
Determinazione della velocità di crescita
Aumento del numero di cellule nel tempo
MTT ASSAY PROTOCOL
1° giorno: SEMINA delle CELLULE
1. tripsinizzare e contare le cellule;
2. diluire propriamente le cellule in terreno di coltura;
3. pipettare le cellule nei pozzetti (100 ml/pozzetto) usando un pipettatore
multicanale (fare attenzione ai volumi pipettati dal pipettatore). Nella colonna 1
e la colonna 12 della piasta vanno pipettati 200 ml di solo terreno e verranno
utilizzati come BIANCHI
2° giorno: TRATTAMENTO
4. diluire il farmaco in modo appropriato in terreno di coltura. Fare una diluizione 2x
rispetto a quella finale voluta, in quanto 100 ml di diluizione saranno aggiunti ai
100 ml già presenti nel pozzetto;
5. aggiungere solo terreno ai pozzetti di controllo (pozzetti delle colonne 2 e 11);
6. aggiungere il farmaco a partire dalla concentrazione più bassa;
3° giorno: TEST MTT
7. aggiungere 50 ml di MTT (2 mg/ml in PBS) ad ogni pozzetto, inclusi quelli di contr
8. tenere le piastre in incubatore per 3 ore;
9. centrifugare le piatre per 10’ a 2000 rpm;
10. rimuovere il terreno di coltura rovesciando le piastre e asciugandole su un foglio
di carta assorbente;
11. aggiungere 120 ml di DMSO ad ogni pozzetto;
12. avvolgere le piastre con alluminio e metterle su un agitatore rotante per 20-30’;
13. leggere le piastre.