COLTURA DI CELLULE
EUCARIOTICHE
Conoscenze teoriche di base e
tecniche operative
Dott. Adriano Angelucci
[email protected]
LTCMA – Marzo 2014
Colture cellulari: pro e contro
• PRO
• Riduzione dell’uso di animali da sperimentazione
• In una linea cellulare le cellule sono omogenee
• Possibilità di controllare l’ambiente extracellulare
• Saggiare le cellule senza l’interferenza di altre
•
•
•
•
componenti presenti in vivo
CONTRO
Le cellule vivono in un ambiente artificiale
Comportamento «anomalo» delle cellule rispetto alla
situazione in vivo
Modello ancora scarsamente predittivo
Obiettivi
• Attraverso l’applicazione di specifiche procedure e tecnologie si
occupa:
• Mantenimento
in vitro delle migliori
sopravvivenza di cellule eucariotiche
condizioni
di
• Permettere la proliferazione delle cellule
• Preservare
da modifiche
contaminazione l’operatore
biologiche
le
cellule
e
da
• Realizzazione di banche per il mantenimento di campioni
cellulari
Alcune tappe della storia
• 1885 Wihelm Roux: prima coltura di tessuto da embrione
•
•
•
•
•
•
di pollo
1907 Ross Granville Harrison & Paul Alfred Weiss:
sperimentazione su cellule «in vitro»
1912 Alexis Carrel: metodologie asettiche
1920 Prima banca di cellule (ECACC, european collection
of cell cultures)
1965 Leonard Hayflick: limite nel numero di divisioni
cellulari
1975 Georges Kohler & Cesar Milstein: primo ibridoma
per produrre anticorpi
1998 James Thomson & John Gearhart isolano cellule
staminali embrionali umane
Ross Granville Harrison
• Espianti di tubo neurale di embrioni di rana
• Coltura in una goccia di linfa di rana contenuta in un
vetrino in ambiente sterile
• Osservazione «in vitro» dello sviluppo nel tempo di fibre
nervose
Maggiori conquiste nelle colture cellulari
• Uso di antibiotici che inibiscono la crescita dei batteri
soluzione 100x di streptomicina (10’000ug/ml) e
penicillina (10’000U/ml)
• Uso della tripsina per staccare le cellule dalla piastra di
coltura senza danneggiarla
tripsina (0,25% )+ EDTA (0,2 mg/ml)
• Uso di terreni di coltura sintetici
Principali aree di studio
• Biologia cellulare: sistemi modello per studiare il
funzionamento delle cellule
• Test di tossicità: valutazione preclinica dei farmaci
• Oncologia sperimentale: carcinogenesi, modelli di
progressione tumorale
• Virologia: ciclo di infezione, produzione di vaccini
• Terapia cellulare/genetica: modificazione delle cellule a
scopo terapeutico
Colture cellulari: conoscenze di base
• Caratterizzazione cellulare
• Requisiti di laboratorio e strumentazione
• Terreni di coltura
• Valutazione del rischio e procedure asettiche
• Banca cellulare e crioconservazione
Laboratorio
• Area isolata e autosufficiente
• Doppia area fisica o temporale: quarantena e routine
• Linee guida per la disposizione degli strumenti e la
sicurezza del personale
• Strumentazione minima:
• Cappa biologica (Biological Safety cabinet)
• Incubatore
• Centrifuga
• Microscopio a contrasto di fase
Cappe biologiche
• Si distinguono in base al livello di contenimento in tre
classi
• Protezione microbiologica (II e III)
• Vari gradi di protezione per l’operatore
• Filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air)
Classe I
Classe II
Classe III
Cappe biologiche
• Cappa a flusso orizzontale
• Protezione microbiologica per le colture
• Nessuna protezione per l’operatore
• Filtri HEPA in entrata
Centrifuga
• Separare le cellule dal liquido
• 300 g x 5 minuti è l’accelerazione per sedimentare le
cellule senza danneggiarle
• Raccomandazioni:
• Localizzazione
• Bilanciamento
• Aereosol
• Rottura delle provette
Centrifuga
• Nomogramma e formula di conversione
Incubatore
• Mantiene le condizioni ambientali ottimali
• Temperatura 37°C
• Umidità (circa 98%)
• pH 7,4 (CO2 sistema tampone bicarbonato)
• Pulizia regolare
• Controllo dei parametri
• Acqua con disinfettante
• Solfato di rame
• Antimicotici
Microscopio a contrasto di fase
• Permette di osservare cellule non colorate
• Frederick Zernike Premio Nobel Fisica 1953
• Limitazioni:
• Alone che circonda le cellule
• Bassa risoluzione (obiettivo 40x)
• Permette l’osservazione solo di
campioni sottili
Funzionamento del contrasto di fase
• Lo spostamento di fase dell’onda
luminosa (non visibile) viene
modificato in spostamento di
ampiezza dell’onda (visibile)
Confronto tra contrasto di fase e ottico
Caratterizzazione cellulare
• Coltura primaria: coltura di cellule prelevate da tessuto
(pura o mista)
• Linea cellulare: unico tipo cellulare adattato alla vita in
coltura (monoclonale)
• Linea cellulare continua (stabile): coltura in grado di
sopravvivere oltre il limite di Hayflick
• Trasformata (immortalizzate)
• Tumorale
• Ibridoma: fusione di due tipi cellulari
Preparazione di una coltura primaria
Ibridoma
• TK:
• Timidina chinasi
• HGPRT:
• Ipoxantina-guanina
• fosforibosiltransferasi
• Terreno HAT
• Ipoxantina
• Aminopterina
• Timidina
Selezione tramite terreno HAT
Morfologia
• Le cellule in coltura possono crescere adese o in
sospensione
• La morfologia è caratteristica del tessuto di origine
Morfologia
• La morfologia è indicatore dello stato della cellula
• Presenza di contaminazioni
Il terreno di coltura
• Precisa formulazione dei componenti per soddisfare le
diverse esigenze di crescita:
• Sali inorganici
• Carboidrati
• Aminoacidi
• Vitamine
• Acidi grassi e lipidi
• Proteine e peptidi
• Siero
Terreni di coltura
Soluzioni saline bilanciate
PBS
Hanks BSS
DPBS
Formano la base dei terreni
complessi
Terreni base
MEM
Colture primarie e cellule
diploidi
DMEM
Maggiori livelli di vitamine e
aminoacidi supporta un gran
numero di tipi cellulari
RPMI1640
Inizialmente usato per cellule di
leucemia supporta un gran
numero di tipi cellulari
Iscoves DMEM
Favorisce la crescita ad alta
densità
Leibovitz L-15
Adatto per atmosfera a bassa
CO2
Ham F10
Ham F12
Necessitano dell’aggiunta di
specifici supplementi
(transferrina, insulina, EGF) e
contengono HEPES
Terreni complessi
Terreni senza siero
Sistemi tampone
• Il mantenimento del pH è importante soprattutto nelle
•
•
•
•
colture primarie
Il pH ottimale è funzione del tipo cellulare (compreso tra
7,0 e 7,7)
Tampone “fisiologico” CO2/CO32-/HCO3- in atmosfera al 510% CO2
Tampone HEPES (7,2-7,4) può essere tossico
Rosso fenolo come indicatore di pH
• Le cellule crescendo possono acidificare il terreno (giallo)
• Anche contaminazioni batteriche acidificano il terreno
• Terreno viola significa che la CO2 è troppo bassa o le cellule sono
morte
Siero
• Formulazione aspecifica di fattori di crescita
• Siero bovino fetale (FBS), siero bovino neonatale (NCS),
•
•
•
•
•
•
siero di cavallo (HS)
Sostegno alla crescita per molti tipi cellulari
Aumenta la capacità tampone
Protegge dai danni meccanici
Facilita l’adesione
Inattivazione del complemento (56°C per 30’)
Apporta circa 5 mg di proteine per ml (10% FBS)
Problematiche
• Rischio per l’operatore
• Contaminazione da microorganismi (batteri, funghi,
micoplasma)
• Contaminazione con altre popolazioni cellulari
• Mantenimento dei caratteri biologici di partenza
Valutazione del rischio
• Prevenire danni ad individui ed ambiente
• Direttive e legislazione europee
• Il rischio dipende dal tipo di coltura:
• Basso rischio=linee continue non umane e linee umane diploidi
ben caratterizzate
• Medio rischio=linee poco caratterizzate
• Alto rischio=colture primarie, linee con patogeni endogeni, linee
infettate
• adeguato contenimento e procedure sempre rispettate
Contaminazione da microorganismi
• I principali tipi di contaminanti microbici
• Batteri e funghi
• Micoplasma
• Virus
• La contaminazione può avvenire:
• Errore dell’operatore
• Terreni contaminati
• Cappa biologica non funzionante
• Incubatore contaminato
• Conservazione in azoto liquido contaminato
Rilevamento della contaminazione
• Modificazione del terreno di coltura: torbidità,
abbassamento del pH
• Segni di sofferenza cellulare: vacuoli, inclusioni
citoplasmatiche, minore adesività
• Il micoplasma può essere rilevato tramite coloranti degli
acidi nucleici (Hoechst 33258, arancio di acridina)
• Il micoplasma può essere individuato tramite test PCR di
amplificazione di sequenze specifiche di mRNA
Disinfettanti
• Principale mezzo per limitare i rischi di contaminazione
• Ipoclorito
• Disinfettante ad ampio spettro, efficace contro virus
• Corrosivo per i metalli, non può essere associato ad altri disinfettanti
• Viene rapidamente inattivato in presenza di composti organici
• 1000ppm per uso generale e 10000ppm per smaltire terreni
• Fenoli
• Non attivo su virus
• Stabile in presenza di composti organici
• Alcoli
• Efficaci al 70% (etanolo) e 60-70% (isopropanolo)
• Etanolo attivo contro batteri e virus con capside
• Isopropanolo non efficace contro virus
• Aldeidi (gluteraldeide, formaldeide)
• Altamente irritanti
• Possono essere usati su superfici metalliche e in forma gassosa
Metodi di disinfezione
• Lampada UV (germicida)
• Sterilizzazione in autoclave
• 121°C per almeno 15 minuti
• Vanno regolarmente pulite tutte le superfici di:
• Cappa biologica
• Incubatore (alta frequenza)
• Piano del microscopio
• Si devono smaltire con attenzione:
• Terreni di coltura (ipoclorito per alcune ore)
• Consumabile a contatto con le colture (eliminato nei rifiuti
appositi)
Contaminazione con altri tipi cellulari
• Più frequente di quanto si immagini
• Avviene quando si lavora contemporaneamente con più
linee
• Si ha inizialmente una popolazione mista e in seguito
solitamente un tipo cellulare prevale
• Manipolare un solo tipo cellulare alla volta
• Mantenere una banca cellulare
Contaminazione batterica e fungina
• Contaminazione ad alta velocità
• Ben evidente ad occhio nudo:
• Intorbidimento del terreno
• Il terreno vira verso il giallo
• Le cellule si staccano dal substrato di crescita
• Batteri e funghi sono ben visibili al microscopio a contrasto di fase
• L’addizione di antibiotici e anti-fungini nel terreno di coltura
offre una protezione generica
• Una contaminazione può essere bloccata in fase iniziale con gli
appropriati antibiotici
• Si preferisce eliminare prima possibile la coltura contaminata
Contaminazione virale
• Non sempre porta alla morte delle cellule
• Virus non visibili al microscopio a contrasto di fase
• Può causare rallentamento nella crescita
• Modifica i caratteri biologici della cellula
• Non può essere eradicata
Contaminazione da micoplasma
• E’ il più piccolo procariota conosciuto (0,35mm)
• E’ un parassita obbligato che risiede nel citoplasma delle
cellule eucariotiche
• Non possiede una parete
• 5 sono le specie che contaminano normalmente le cellule
in coltura
• Le conseguenze sul metabolismo cellulare sono evidenti
solo in tempi lunghi:
• Riduzione del tasso proliferativo
• Cambiamento della morfologia
• Aberrazioni cromosomiche
• Alterazione del metabolismo degli aminoacidi e degli acidi nucleici
Contaminazione da micoplasma
• Dato che le alterazioni sono sottili e i metodi di rivelazione
complessi la contaminazione da micoplasma è molto
diffusa (25%)
• Viene rivelata tramite test specifici che devono essere
effettuati periodicamente:
• Colorazione del DNA nel citoplasma
• Crescita in agar
• Amplificazione delle sequenze in PCR
• Test Elisa
Mantenimento dei caratteri biologici originari
• Lo sperimentatore per offrire significato scientifico ai
propri risultati deve assicurare che:
• Il tipo cellulare usato corrisponda agli standard depositati nelle
banche cellulari
• Non sia in alcun modo contaminato
• Non abbia subito modificazioni biologiche a seguito delle condizioni
di coltura
Pratica della “banca cellulare”
• Non
è consigliabile mantenere (o programmare di
mantenere) per lungo tempo in coltura una popolazione
cellulare:
• Rischio di contaminazioni
• Perdita dei caratteri biologici di interesse
• Deriva genetica
• Limite di duplicazioni nelle cellule diploidi
• Costi legati al mancato utilizzo
• Il sistema della banca cellulare assicura:
• Qualità costante
• Esperimenti eseguiti ad un numero di passaggi comparabili
• Le cellule sono coltivate solo quando servono
• I caratteri biologici iniziali sono preservati
Schema di banca cellulare
Crioconservazione
• Procedura che permette di preparare stock cellulari
• Indicazioni generali:
• Congelamento lento (pochi gradi al minuto)
• Scongelamento rapido (subito a 37°C)
• Vitalità superiore al 90%
• Cellule in fase di crescita logaritmica
• Alta percentuale di siero (>20%)
• Criopreservante: DMSO (10%) o glicerolo
• Conservazione a t<-135°C (vapori di azoto, o azoto liquido)
• Sistema di catalogazione
Regole base: cosa fare
• Usare sempre camice e guanti. Protezioni particolari sono
necessarie quando si maneggia l’azoto liquido
• Pulire tutte le superfici prima di ogni operazione e tra operazioni
diverse (o diverso operatore)
• Identificare in maniera chiara tutti i contenitori che si usano
• Tenere in ordine e mantenere le superfici di lavoro il più possibile
sgombre da oggetti
• Maneggiare una sola linea cellulare alla volta
• Controllare i terreni giornalmente per la presenza di
contaminazione o di altre alterazioni
• Rispettare le scadenze di pulizia e di controllo di incubatore e
cappa biologica
Regole base: cosa non fare
• Permettere l’accesso contemporaneo di più persone
nel laboratorio
• Manipolare cellule di dubbia origine nell’area
principale di lavoro o contemporaneamente alle altre
linee cellulari
• Tenere le cellule in coltura per lungo tempo
• Tenere le cellule per troppo tempo a confluenza
• Usare terreni completi oltre le 6 settimane
Procedura asettica 1
• Disinfettare la cappa con EtOH 70%
• Disinfettare i guanti con EtOH 70% e lasciarli
asciugare per 30 sec prima di iniziare
• Disporre i reagenti sotto cappa dopo avere disinfettato
le superfici esterne
• L’ingresso delle mani nella cappa deve essere lento
• Disinfettare tutto il materiale usato prima di portarlo
fuori cappa
Procedura asettica 2
• Avere sempre presente quali sono le superfici e i liquidi
sicuramente sterili
• Considerare la direzione del flusso di aria sterile
• I terreni di coltura e gli scarti liquidi vanno neutralizzati
con ipoclorito per almeno 2 ore
Colture di cellule adese
• la densità cellulare deve essere mantenuta all’interno di
valori limite per:
• Mantenere costante il tasso di crescita
• Evitare la selezione di nuovi cloni
• La crescita viene valutata come grado di confluenza
Inibizione da contatto
• Cellule normali quando vengono a contatto interrompono
la loro proliferazione ed entrano in fase G0
• Le cellule trasformate e tumorali non risentono
dell’inibizione da contatto
Grado di confluenza
• Quanta superficie di crescita è occupata dalle cellule
• Quando le cellule coprono l’80% della superficie vanno
spostate (passate) in un nuovo contenitore
• Se lasciate ad un alto grado di confluenza per troppo
tempo le cellule cambiano fenotipo e possono diventare
più difficili da staccare
•
• Solitamente la crescita esponenziale si ha con valori di
densità compresi tra 104 e 105 cellule per cm2
Colture di cellule adese
Numero di cellule
• La linea deve essere mantenuta a crescita esponenziale
2
3
4
5
6
7
Densità cellulare (10x)
• Conoscenza della superficie di semina
• Cellule seminate ad una confluenza troppo bassa entrano
in uno stato di quiescenza e non proliferano
Numero di passaggi
• Il numero di volte che la coltura è stata passata («split»)
in un nuovo recipiente
• Va sempre indicato sul contenitore
• Si consiglia di usare le cellule non oltre un certo numero
di passaggi per evitare le modificazioni fenotipiche indotte
dalla coltura prolungata
Protocollo: sottocoltura di cellule aderenti
• Le cellule smettono di crescere quando raggiungono il
100% di confluenza o in seguito ad esaurimento dei fattori
nutritivi
• Le cellule vanno portate in sospensione
• Si utilizzano proteasi, soluzioni di proteasi e agenti
alchilanti o metodi meccanici
Procedura (1)
• Accertarsi della confluenza e dello stato delle cellule
• Rimuovere il terreno
• Lavare lo strato cellulare con PBS senza Ca2+ e Mg2+
con un volume equivalente a metà volume del terreno
usato. Ripetere se le cellule hanno alta capacità adesiva
• Aggiungere 1ml di tripsina/EDTA ogni 25cm2 di superficie.
Fare in modo che il liquido bagni tutta la superficie
• Mettere il contenitore in incubatore per 2-10 minuti
Tripsina EDTA
• La tripsina è un enzima proteolitico che permette il
distacco delle cellule dalla piastra di coltura
• La tripsina taglia i legami peptidici
• EDTA chela gli ioni calcio nel terreno che inibiscono
l’azione della tripsina
• La tripsina si autodigerisce a 37°C dopo 20 minuti
• Lasciare le cellule in incubazione con la tripsina ne riduce
la vitalità
Procedura (2)
• Osservare le cellule al microscopio per accertarsi che
•
•
•
•
•
•
siano in sospensione
Agevolare il distacco meccanicamente
Diluire le cellule in terreno contenente siero
Centrifugare
Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un
appropriato volume di terreno completo
Contare le cellule
Prelevare il volume contenente il numero di cellule
necessario
Punti cruciali
• Diversi tipi cellulari hanno capacità adesive molto diverse
• La presenza di EDTA aiuta il distacco delle cellule
• L’eliminazione di siero è fondamentale per aumentare
l’efficacia della tripsina
• L’esposizione prolungata a tripsina può danneggiare
irreversibilmente le cellule
• La fase di centrifugazione può essere omessa se si usano
elevate quantità di siero
• La tripsina danneggia le proteine di superficie
Procedura di conta
• Centrifugare
• Risospendere in un piccolo volume di terreno completo
• Prelevare 100 ml di sospensione
• Aggiungere un ugual volume di Trypan Blue (0,4%)
• Riempire le camere del vetrino (5-10 ml)
• Osservare al microscopio ad ingrandimento 20x
• Calcolare il numero di cellule secondo le specifiche del
vetrino di conta (dimensioni del reticolo)
Trypan Blue
• Colorazione per esclusione
• Le cellule vive non assorbono il colorante
• Le cellule morte con membrana rotta assorbono il
colorante e si colorano di blu
Camere di conta (emocitometri)
• Vetrini speciali che presentano una griglia microscopica
che serve per contare le cellule
Calcolo del numero di cellule
• A= media delle cellule vive
• B= media delle cellule morte
• C= fattore di diluizione
• D= fattore di conversione in ml
• Concentrazione cellule vive= A*C*D
• Concentrazione cellule morte=B*C*D
Volume della conta= 0,1x 1
mm2=0,1
mm3
Fattore di conversione= 104
(0,1 mm3=0,1ul= 10-4ml)
Punti cruciali
• Un’adeguata accuratezza della misura si ottiene contando
•
•
•
•
•
almeno 100 cellule
Il Trypan blue è tossico ed è un potenziale carcinogeno
Le cellule devono essere ben distinte e uniformemente
distribuite
Evitare la presenza di bolle e detriti
Non riempire eccessivamente la camera
Se le cellule sono poche, operare una nuova
centrifugazione e risospendere in meno terrreno
Calcolo della vitalità cellulare
• Colorazione con Trypan Blue
• Le cellule vive sono impermeabili al Trypan Blue mentre
le cellule morte assorbono il colorante
• Mescolare trypan blue con un’aliquota delle cellule da
valutare
• Conta alla camera di conta per stabile il numero di cellule
vive (Nv) e il numero di cellule morte (Nm)
• % di vitalità = (Nv X 100)/(Nv+Nm)
Adesione cellulare
ancoraggio
migrazione – “homing”
comunicazione - anoikis
Tipologie di migrazione
• Chemotassi: movimento guidato da un fattore
solubile
• Aptotassi: movimento guidato da sostanze
presenti nella matrice extracellulare non diffusibili
• Chemotropismo: crescita (senza movimento) dei
tessuti verso una sostanza attraente
Test di adesione
• Valutazione della capacità delle cellule di aderire su un
substrato fisiologico (collagene, fibronectina, laminina…)
• Cerca di riprodurre le condizioni in vivo
• La crescita su matrici biologiche modifica la morfologia e la
capacità di crescita delle cellule
• La presenza di proteine di matrice può stimolare la migrazione
• L’adesione può essere un bersaglio farmacologico per impedire
la diffusione del tumore
Test di adesione
• Conta cellulare (stesso numero di cellule per pozzetto)
• Incubazione a 37°C per 30 minuti – 1 ora
• Eliminazione delle cellule non adese
• Fissaggio delle cellule
• Colorazione delle cellule