Coltura Primaria
Coltura a Breve
Termine
Coltura a Lungo
Termine
< 10 duplicazioni
50/60
duplicazioni
Coltura Secondaria
Linea Cellulare Continua
>150/200 duplicazioni
Linea Cellulare Continua
•E’ capace di crescere
indipendentemente dall’organismo
originale da cui è derivata
•Crescita ininterrotta per oltre 1 anno
•Immortale
Linea Cellulare Continua
Subclone
• derivata dalla linea cellulare parentale, ma con
caratteristiche divergenti/uniche
Linee Sorelle Simultanee
• stabilizzate da differenti siti dello stesso
organismo
• il campione primario è stato suddiviso in più
aliquote prima della semina
Linee Sorelle Seriali
• stabilizzate dallo stesso organismo, ma in
differenti momenti (ad esempio alla diagnosi ed
alla recidiva)
Stabilizzazione di Nuove Linee
Cellulari
•
Estremamente Difficile
•
Rari Successi e Non Prevedibili
•
Importanza delle Aberrazioni
Cromosomiche e/o Mutazioni
Genetiche
•
Diagnosi vs Ricaduta: diverse
percentuali di successo
Scarsa
riproducibilità
della metodica in
altri laboratori
The leukemia-Lymphoma Cell Line
FactsBook di H.G. Drexler, 2000
IN VIVO
La pressione parziale di ossigeno nei
normali fluidi corporei è
significativamente più bassa di quella
dell’aria.
Nel midollo osseo umano è di circa il 25%.
EX VIVO
Incubatore
La pressione parziale di ossigeno negli
incubatori al 5% di CO2 è di circa 1520%!!!
In alcuni casi è utile ridurre la fase
gassosa di ossigeno tra 1-10%.
Alcune linee cellulari crescono al 5% di
ossigeno ed il 6% di anidride carbonica.
Deterioramento della Coltura
Possibili ragioni
• Le cellule neoplastiche cessano di proliferare
• Overgrowth di fibroblasti o macrofagi
• Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+
B
B
B
B
LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA
LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI
• Medium di coltura:
RPMI 1640, IMDM, McCoy’s, Alpha MEM
e DMEM
• Fattori di crescita:
EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6,
SCF, PHA e CM
• Supporto colturale (plastica)
• Concentrazione cellulare
• Superamento della crisi di
stabilizzazione
Medium di Coltura
“Ioni Inorganici”
Cloruro di calcio anidro
Solfato di magnesio anidro
Cloruro di potassio
Nitrato di potassio
Cloruro di sodio
Fosfato di sodio bibasico
Bicarbonato di Sodio
Medium di Coltura
“Aminoacidi-Isomeri L”
Alanina
Arginina
Asparagina
Acido Aspartico
Cisteina
Glutamina
Acido Glutamico
Glicina
Istidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Medium di Coltura
“Vitamine”
Biotina
Pantotenato
Acido Folico
Inositolo
Nicotinamide
Piridossina
Riboflavina
Tiamina
Vitamina B12
Medium di Coltura
“Altri Componenti”
Glucosio
Hepes
Rosso fenolo
Sodio Piruvato
Siero fetale bovino (10%-20%)
Aminoacidi non-essenziali
Sistema Tampone
Metaboliti
Alterazione del pH
Rallentamento della crescita
Morte cellulare
E’ essenziale che il pH sia controllato attraverso un Sistema Tampone
BICARBONATO-ANIDRIDE CARBONICA
BICARBONATO-ANIDRIDE CARBONICA
Il sistema è costituito dal bicarbonato di sodio (oppure di potassio), presente in
qualità di nutriente del medium, e dall’anidride carbonica presente
nell’atmosfera degli incubatori a CO2
H2O+CO2
H2CO3
NaHCO3
H+ + HCO3-
Na+ + HCO3-
pH alcalino del medium:
viene corretto dalla formazione di ioni carbonato (che si formano a seguito della
ionizzazione dell’acido carbonico derivato a sua volta dalla dissoluzione in acqua
della CO2)
pH acido del medium:
viene corretto dalla formazione di bicarbonato di sodio (che deriva dall’eccesso
di carbonato)
•L’equilibrio tra carbonato e bicarbonato di sodio è mantenuto nel medium
di coltura grazie alla presenza della CO2
•Il pH è mantenuto tra 7 e 7.4 nel medium di coltura
Supporto Colturale
E’ noto che alcuni tipi cellulari necessitano di
supporti specifici.
Ne è un esempio la coltura di cellule
staminali embrionali murine:
Piatre Petri da 35,60 e 100 mm: Falcon
Fiasche e Multiwell: Nunc
Methods in Molecular Biology, Vol. 185,
Casa Editrice Humana Press