Oncologia Sperimentale di
laboratorio
PREVENZIONE DELLA
CONTAMINAZIONE DELLE
COLTURE CELLULARI E
CONSERVAZIONE
6° S. Beninati
CONTAMINAZIONE DA BATTERI E FUNGHI
•
ALCUNE PROCEDURE DI BASE VENGONO UTILIZZATE AL FINE DI
RIDURRE LA CONTAMINAZIONE DELLE COLTURE CELLULARI
•
TRA I VARI ACCORGIMENTI, LA FILTRAZIONE DEL MEZZO DI
COLTURA RAPPRESENTA UNO DEI MEZZI PIU’ EFFICACI PER
PREVENIRE LA CONTAMINAZIONE DA BATTERI
•
A TAL FINE POSSONO ESSERE USATI FILTRI CON VARIE POROSITA’
A SECONDA DEL TIPO DI APPLICAZIONE:
•
•
•
•
0.8 μm………………………….PREFILTRAZIONE
0.45 μm ………………………..PREFILTRAZIONE CHIARIFICAZIONE
0.2 μm …………………….…...STERILIZZAZIONE
0.1 μm …………………………RITENZIONE DI MICOPLASMI
PREFILTRAZIONE
• LA PREFILTRAZIONE CON MEMBRANE
DA 0.8 E 0.45 PERME DI FILTRARE I
MEZZI CON I FILTRI DA 0.2 O 0.1 CON
PIU’ RAPIDITA’.
• TALE PREFILTRAZIONE E’
NECESSARIA IN PRESENZA DI SIERO
FETALE BOVINO A CAUSA
DELL’INTASAMENTO DEI FILTRI DA 0.2
• I FILTRI VENGONO PROVATI MISURANDONE LA
RITENZIONE BATTERICA DALL’AMERICAN SOCIETY
FOR TESTING AND MATHERIAL (ASTM)
• 0.45 μm……..SERRATIA MARCESCENS ATCC 14756
• 0.2 μm…..PSEUDOMONAS DIMINUTA ATCC 19146
• IL PSEUDOMONAS DIMINUTA RAPPRESENTA UNO
DEI PIU’ COMUNI CONTAMINANTI CAPACE DI
ATTRAVERSARE LE MEMBRANE DA 0.45 μm
LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST
• LA FILTRAZIONE, PUR RENDENDO
STERILE IL MEZZO NON RISOLVE IL
PROBLEMA DELLA PRESENZA DELLE
ENDOTOSSINE DI ORIGINE BATTERICA
• AL FINE DI SAGGIARE LA PRESENZA
DI ENDOTOSSINE SI UTILIZZA IL L. A. L.
TEST (LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE
TEST)
FILTRAZIONE
• E’ OPPORTUNO FILTRARE IL MEZZO DI COLTURA,
PREPARATO SOTTO CAPPA , A FLUSSO LAMINARE
VERTICALE
• IN TEORIA, PER ELIMINARE LA POSSIBILITA’ DI
FORMARE SCHIUME, LA FILTRAZIONE DOVREBBE
AVVENIRE CON PRESSIONE POSITIVA
• IN PRATICA TUTTI I SISTEMI IN COMMERCIO SONO
DI TIPO NEGATIVO, CIOE’ SFRUTTANDO IL VUOTO
COME MEZZO DI MOVIMENTO
FILTRAZIONE CON SIRINGA
• LA SIRINGA CON APPLICATO UN
FILTRO DA 0.22 μm E’ UN SISTEMA DI
FILTRAGGIO A PRESSIONE POSITIVA
OTTIMO IN GENERE PER PICCOLI
VOLUMI (MAX 100 ml)
• LA PRESSIONE PUO’ ESSERE UN
PARAMETRO CRITICO IN TUTTI I
SISTEMI
CONSERVAZIONE DELLE CELLULE PER
CRIOCONSERVAZIONE
• LA CRIOCONSERVAZIONE E’ ATTUALMENTE
L’UNICA TECNICA UTILIZZABILE PER
CONSERVARE PER TEMPI LUNGHI LE
CELLULE.
• LA CONSERVAZIONE DELLE CELLULE PER
TEMPI BREVI PUO’ ESSERE ATTUATA
MANTENENDOLE SOSPESE NEL MEZZO DI
COLTURA A 0-4 °C (AL MAX PER 2-3 GIORNI)
VANTAGGI DELLA CRIOCONSERVAZIONE
• I VANTAGGI DELLA CRIOCONSERVAZIONE SONO
MOLTEPLICI:
• E’ UNA METODICA RELATIVAMENTE ECONOMICA, RICHIEDE:
AZOTO LIQUIDO CONSERVATO IN CONTENITORI ADATTI
• PERMETTE IL RECUPERO DELLE CELLULE CON IL
PATRIMONIO GENETICO INTATTO
• I TEMPI DI CONSERVAZIONE SUPERANO I 50 ANNI
• LE PROCEDURE DI CONGELAMENTO E SCONGELAMENTO
SONO RELATIVAMENTE CRITICHE E LA RESA IN CRESCITA E’
GENERALMENTE ELEVATA
PUNTI CRITICI
• LA TEMPERATURA IDEALE DI CONSERVAZIONE NON DEVE
SUPERARE I -135 °C
• I PUNTI CRUCIALI DELLA PROCEDURA SONO IL
CONGELAMENTO E LO SCONGELAMENTO, I QUALI
INFLUENZANO LA SOPRAVVIVENZA CELLULARE
• LA MORTALITA’ CELLULARE DERIVA ESSENZIALMENTE
DALLO SHOCK-TERMICO AL QUALE LE CELLULE SONO
SOTTOPOSTE
• L’ABBASSAMENTO DELLA TEMPERATURA DEVE ESSERE
OPPORTUNATAMENTE CONTROLLATO AL FINE DI RIDURRE
LA MORTALITA’ CELLULARE
PROTOCOLLO CONGELAMENTO
•
•
•
•
MEZZO DI COLTURA CON IL CRIOCONSERVANTE:
MEZZO TAMPONATO
65%
SIERO
25%
GLICEROLO
10% *
•
SOSPENDERE LE CELLULE NEL MEZZO(5-10·106 CELLULE / ml)
•
TRASFERIRE LE CELLULE IN PROVETTE DI CRIOCONSERVAZIONE
•
IMMERGERE LE PROVETTE CHIUSE IN ALCOOL 90°
•
•
PORRE LE PROVETTE IN UNA SCATOLA DI POLISTIROLO E CONSERVARLE A
-20°C PER 30’, QUINDI A -80°C PER 60’CONGELARE IN AZOTO LIQUIDO
•
* DMSO 10%
TUTTO STERILE
REGOLE GENERALI :
•
VELOCITA’ TROPPO LENTE DI CONGELAMENTO LA CELLULA E’
ESPOSTA A CONCENTRAZIONI CRESCENTI DI SOLUTI
EXTRACELLULARI PER L’ELEMINAZIONE DI ACQUA TRASFORMATA
IN GHIACCIO.
•
I DANNI PRODOTTI DAERIVANO DALLA VARIAZIONE DEL pH DEL
MEZZO E DALLA PRESSIONE OSMOTICA ESTERNA (LE CELLULE
PERDONO ACQUA)
•
VELOCITA’ DI RAFFREDDAMENTO TROPPO ELEVATE PROVOCANO
LA FORMAZIONE DI NUCLEI DI CRISTALLIZZAZIONE SIA NEL MEZZO
CHE ALL’INTERNO DELLE CELLULE.
TALI NUCLEI SI TRASFORMANO IN GROSSI CRISTALLI DI GHIACCIO
CON RELATIVO DANNO MECCANICO ALLE CELLULE
•
•
LA VELOCITA’ DI RAFFREDDAMENTO OTTIMALE E’ STATA VALUTATA
IN -1 °C AL MIN. (VALORE MEDIO)
MEZZI UTILIZZATI PER EFFETTUARE IL
RAFFREDDAMENTO
– TRASFERIMENTO DEI VIALS CONTENENTI LE CELLULE DA
CONGELARE IN UN CONTENITORE DI POLISTIROLO
TRASFERITO IN FREEZER A -20 °C E QUINDI A -80° C
(ESITONO CONTENITORI IN VENDITA)
– FREEZER MECCANICI PROGRAMMABILI (PRECISI
COSTOSI)
E
INFINE LE CELLULE VENGONO RISPOSTE IN AZOTO LIQUIDO.
LO SBALZO TERMICO IN TAL CASO NON HA ALCUN EFFETTO
NORME GENERALI PER LO SCONGELAMENTO DI
CELLULE
• VANTAGGI DEL CONGELAMENTO: ASSICURARSI DI
CONSERVARE LA STABILITA’ GENETICA DELLE
CELLULE POICHE’ SONO POSSIBILI MUTAZIONI O
SELEZIONI CHE POSSONO ESSERE INDOTTE
DALLA SUBCULTURA
• PREPARAZIONE DELLE CELLULE PER LO
SCONGELAMENTO: COME IL CONGELAMENTO
ANCHE LO SCOGELAMENTO RAPPRESENTA UNA
FASE CRITICA
• LO SCONGELAMENO DEVE ESSERE RAPIDO DOPO
AVER TOLTO LE CELLULE DALL’AZOTO LIQUIDO
PORLE A 37°C IN UN BAGNOMARIA
TEMPI DI RISCALDAMENTO
• I TEMPI DI RISCALDAMENTO (37°C40°C) SONO DIVERSI A SECONDO DEL
TIPO DI VIALS
•
•
1MINUTO PER VIALS DI VETRO
90SECONDI PER VIALS DI PLASTICA
NORME GENERALI
• E’ OPPORTUNO NON AGITARE LE VIALS E NON SUPERARE I
TEMPI INDICATI.
• PRIMA DI APRIRE I VIALS ACCERTARSI CHE NON SI
SVILUPPINO BOLLE DAL PUNTO DI CONTATTO TRA IL TAPPO
E IL CONTENITORE TALE SEGNO E’ UNA CHIARA
INDICAZIONE DI ASSENZA DI ERMETICITA’.
•
LE CELLULE SONO SICURAMENTE CONTAMINATE O QUANTO
MENO DANNEGGIATE DAL CONTATTO DIRETTO CON L’AZOTO
LIQUIDO.
• PRIMA DI TOGLIERE IL TAPPO LAVARE I VIALS CON ALCOOL
PER RIDURRE LA CONTAMINAZIONE
CICLO O CURVA DI CRESCITA*
•
* (IL CICLO O CURVA DI CRESCITA NON DEVE ESSERE CONFUSO
CON IL CICLO CELLULARE O INTERFASE CHE CONDUCE ALLA
MITOSI O ALLA MEIOSI)
•
È ESSENZIALE CONOSCERE I PARAMETRI RELATIVI AL CICLO DI
REPLICAZIONE DELLE CELLULE DA COLTIVARE.
•
IL CICLO DI CRESCITA CONTROLLA INFATTI MOLTI PASSAGGI CHE
SONO NECESSARI PER LA COLTURA DI CELLULE ANIMALI.
•
TRA I PIÙ IMPORTANTI RICORDIAMO:
–
–
–
–
–
LA DENSITÀ CELLULARE DI SEMINA
IL TEMPO DI CRESCITA
LA DURATA DI UN ESPERIMENTO
IL MOMENTO ADATTO PER IL PRELIEVO DEI CAMPIONI
IL METABOLISMO CELLULARE
•
È NECESSARIO CONSIDERARE, NEL PREPARARE
UN ESPERIMENTO, CHE CELLULE CHE SI TROVANO
IN FASI DIVERSE DEL CICLO DI CRESCITA SI
COMPORTANO IN MODO DIVERSO RISPETTO A
DIVERSI PARAMETRI BIOLOGICI COME:
–
–
–
–
–
ATTIVITÀ ENZIMATICHE
PROLIFERAZIONE
GLICOLISI E RESPIRAZIONE CELLULARE
SINTESI DI PRODOTTI SPECIFICI
INTERAZIONI CON LA MATRICE EXTRACELLULARE
FASI DEL CICLO DI CRESCITA
• IL CICLO DI CRESCITA È DIVISO IN TRE
FASI:
• FASE LAG
• FASE LOG
• FASE DI PLATEAU
FASE LAG
•
CORRISPONDE AL TEMPO IMMEDIATAMENTE SUCCESSIVO ALLA
SUBCULTURA E ALLA SEMINA.
•
IL NUMERO DI CELLULE CHE SI DIVIDE IN TALE FASE È MINIMO.
•
TALE PERIODO È ANCHE DETTO DI ADATTAMENTO.
•
DURANTE TALE FASE LE CELLULE RIPRISTINANO GLI ELEMENTI
DELLE MEMBRANE CELLULARI PERSI IN SEGUITO ALLA
TRIPSINIZZAZIONE (ANCHE DETTA PEELING, POICHÈ LE PROTEINE
DI SUPERFICIE VENGONO TAGLIATE), SI ATTACCANO AL
SUBSTRATO POICHÉ SINTETIZZANO LE PROTEINE DELLA MATRICE
EXTRACELLULARE (FIBRONECTINA IN PARTICOLARE) E SI
DISTRIBUISCONO SU TUTTA LA SUPERFICIE DISPONIBILE.
•
IL CITOSCHELETRO SI ASSEMBLA E MOLTI ENZIMI COME LA DNA
POLIMERASI AUMENTANO, SEGUITI DALLA SINTESI DI NUOVO DNA
E PROTEINE STRUTTURALI.
FASE LOG
•
QUESTO È IL PERIODO DI AUMENTO NUMERICO ESPONENZIALE.
•
•
•
•
LA DURATA DI QUESTA FASE È DIRETTAMENTE CORRELATA CON:
1. LA DENSITÀ DI SEMINA,
2. IL GRADO DI CRESCITA DELLE CELLULE IN QUELLE CONDIZIONI
3. LA DENSITÀ MINIMA DI INIBIZIONE DELLA PROLIFERAZIONE.
•
DURANTE QUESTA FASE IL NUMERO DI CELLULE IN DIVISIONE È
MOLTO ALTO (~ 90-100% IN GENERE) E IL MODELLO È ALTAMENTE
RIPRODUCIBILE.
QUINDI È IL MOMENTO OTTIMALE PER RACCOGLIERE CAMPIONI,
SIA PER LA RIPRODUCIBILITÀ CHE PER LA VITALITÀ CELLULARE
ELEVATA.
È BENE CONSIDERARE CHE LE CELLULE NON SONO
SINCRONIZZATE, SI TROVANO CIOÈ DISTRIBUITE IN MANIERA
RANDOM NEL CICLO CELLULARE.
•
•
FASE DI PLATEAU
•
VERSO LA FINE DELLA FASE LOG, , LE COLTURE DIVENTANO CONFLUENTI OCCUPANDO
TUTTA LA SUPERFICIE DISPONIBILE.
•
LA CRESCITA CELLULARE IN TALI CONDIZIONI È MOLTO RIDOTTA FINO A CESSARE.
•
LA FASE RAGGIUNTA È DETTA STAZIONARIA O DI PLATEAU.
•
LA MORFOLOGIA CELLULARE CAMBIA E IL BLOCCO DELLA MOTILITÀ, IL MUTAMENTO
DELLE MEMBRANE CELLULARI E LA MANCANZA DI CRESCITA SONO DEFINITE COME
“INIBIZIONE DA CONTATTO” (ALBERCOMBIE E HEAYSMAN, 1965).
•
IL TERMINE “INIBIZIONE DA CONTATTO” È STATO DEFINITO COME IMPRECISO, POICHÉ
LA RIDUZIONE DELLA CRESCITA DELLE CELLULE NORMALI NON È DOVUTA
ESCLUSIVAMENTE AL CONTATTO, MA PUÒ COINVOLGERE ALTRI FATTORI, TRA I QUALI
LA MANCANZA DI NUTRIENTI E L’IMPOSSIBILITÀ DI COLONIZZARE NUOVI SPAZI.
•
•
•
SI PREFERISCE IL TERMINE “LIMITAZIONE DELLA CRESCITA DA DENSITÀ” (STOKER E
RUBIN, 1967).
IL TERMINE “INIBIZIONE DA CONTATTO” È TUTTAVIA CONSERVATO A QUEI CASI IN CUI
IL CONTATTO FISICO È L’UNICO ELEMENTO LIMITANTE LA CRESCITA.
DIPENDENZA DALLA ADESIONE CELLULARE
• È NECESSARIO DISTINGUERE INIBIZIONE DA CONTATTO E
INIBIZIONE DA DENSITÀ.
•
NEL PRIMO CASO, COME OGGETTO DEL CONTATTO SI
CONSIDERANO LE CELLULE E IL LORO ANCORAGGIO.
•
NON CRESCONO LE CELLULE ALLE QUALI VIENE A MANCARE
L’ANCORAGGIO CON IL SUBSTRATO.
•
• AD ESEMPIO LE CELLULE EPITELIALI E ENDOTELIALI
NORMALI SMETTONO DI CRESCERE ALLA CONFLUENZA
FORMANDO DEI MONOSTRATI.
CELLULE TUMORALI
• MOLTE COLTURE, RAGGIUNTA LA CONFLUENZA
POSSONO CONTINUARE A PROLIFERARE
(CELLULE TUMORALI) FORMANDO MULTISTRATI E
SMETTONO DI CRESCERE PER MANCANZA DI
NUTRIENTI.
•
• LE CELLULE TRASFORMATE POSSONO
RAGGIUNGERE ALTE DENSITÀ NELLA FASE
STAZIONARIA.
• LA FRAZIONE IN CRESCITA È MOLTO ALTA E LA
INIBIZIONE DA DENSITÀ È NULLA.
CURVA DI CRESCITA
• DALLA COSTRUZIONE DI UNA CURVA DI CRESCITA
SI POSSONO DEDURRE VARI PARAMETRI:
• IL PERIODO DEL LAG (“LAG TIME”)
• IL TEMPO DI RADDOPPIAMENTO
• (“DOUBLING TIME”)
• LA SATURAZIONE DI DENSITÀ (“SATURATION
DENSITY”)
LAG TIME
•
1 → SI OTTIENE DISEGNANDO UNA LINEA DALLA CURVA DI LOG TIME FINO
AD INTERSECARE LA CONCENTRAZIONE IN CELLULE/ml DELL’INOCULO.
LOG TIME
•
2 → RAPPRESENTA IL TEMPO NECESSARIO ALLE COLTURE PER
AUMENTARE DEL DOPPIO NEL CENTRO DELLA FASE LOG
(QUESTO E’ UN PARAMETRO CARATTERISTICO PER OGNI LINEA CELLULARE)
DT-DOUBLING TIME
PLATEAU
•
3 → RAPPRESENTA LA CONCENTRAZIONE DELLE CELLULE NELLA FASE
STAZIONARIA.
S.D. saturation density
CURVA DI CRESCITA DI DUE LINEE CELLULARI (HELA E NFL). LA LINEA
INTERA È PER LE HELA E QUELLA TRATTEGGIATA PER LE NFL. DTDOUBLING TIME;NFL-NORMAL FETAL LUNG FIBROBLAST; *-SE IL MEZZO
DI COLTURA NON VIENE SOSTITUITO LE CELLULE MUOIONO; SDSATURATION DENSITY.
Colture primarie
• Una coltura primaria viene generata isolando cellule
direttamente a partire da tessuti o organi, le cellule
isolate in questo modo riflettono meglio le attività
biochimiche delle cellule in vivo, tuttavia hanno una vita
limitata e, per la realizzazione di progetti a lunga
scadenza, è necessario prevedere diversi isolamenti.
• Per procedere all’isolamento di una coltura primaria da
tessuto occorre tener presente che un tessuto è
composto di tipi cellulari diversi, tenuti insieme da
matrice; è quindi necessario rompere la matrice per
separare le cellule procedendo poi alla selezione dei tipi
cellulari necessari per gli scopi sperimentali.
procedura
• La procedura prevede che il campione di tessuto sia
trattato con tripsina e collagenasi allo scopo di digerire la
matrice extracellulare, e con EDTA allo scopo di chelare
il Ca++ da cui dipende l’adesione cellula-cellula.
Dalla sospensione cellulare ottenuta si ottiene una
coltura primaria.
Le cellule della coltura primaria aderiscono alla piastra e
crescono fino a coprire tutta la superficie disponibile.
A questo punto vengono rimosse dalla piastra di coltura
e sistemate in nuove piastre.
Le colture primarie non sono sterili, quindi è obbligato
l’uso di antibiotici.
Tipi di colture
• A seconda che la coltura richieda di aderire ad una superficie o
cresca in un mezzo liquido, si distinguono colture adese da quelle in
sospensione.
• Alcuni tipi cellulari, caratterizzati da crescita
adesa, per effetto dell’inibizione da contatto,
smettono di proliferare quando formano un
monostrato.
• Le superfici di coltura più comuni erano le
capsule di Petri, attualmente sono i
micropozzetti e le fiasche, disponibili in varie
misure e composte da materiale plastico trattato
opportunamente in modo da esporre cariche
negative che favoriscano l’adesione cellulare.
CAPSULA PETRI
MICROPOZZETTI
FIASCHE
Immortalizzazione
• Dopo un certo numero di duplicazioni (variabile per tipo
cellulare), le cellule primarie smettono di dividersi e
muoiono per effetto dell’ accorciamento dei telomeri.
• Per ottenere una linea cellulare capace di proliferare
illimitatamente (linea cellulare continua), è necessario
immortalizzare la coltura; esistono diversi metodi per
ottenere questo risultato, per esempio:
• Introduzione del gene esogeno che codifica per la
subunità catalitica della telomerasi
• Utilizzo di oncogeni derivati da virus tumorali (antigene T
di SV40), che innescano meccanismi di trasformazione
simili a quelli che determinano la proliferazione tumorale.
Hela
• Cellule provenienti da tessuti tumorali
sono linee cellulari naturalmente
immortalizzate, non a caso la prima linea
cellulare continua è stata isolata da
George Gey nel 1951 da tessuto tumorale
di cervice uterina (Hela).
linee cellulari
• La possibilità di produrre linee cellulari continue
permette di ridurre la variabilità sperimentale
legata all’utilizzo di colture primarie garantendo
maggiore riproducibilità.
• Nell’analisi dei risultati occorre però tenere
presente che la coltura immortalizzata è in
genere più lontana dalle condizioni fisiologiche
dell’organismo di partenza.
linee cellulari continue
• Diverse strutture si sono negli ultimi anni specializzate
nella conservazione e propagazione di cellule su larga
scala; sono infatti commercialmente disponibili per i
ricercatori di tutto il mondo diverse collezioni di linee
cellulari, per esempio :
• ATCC - American Type Culture Collection
• DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell
Cultures
• ECACC - European Collection of Animal Cell Culture
LINEE CELLULARI
• Ciascuna di queste collezioni fornisce, oltre alla
possibilità di acquistare la linea cellulare di
interesse, anche informazioni sperimentali a
corredo che riguardano sia il protocollo di
mantenimento della linea in coltura, ma anche la
specie e il tessuto di provenienza, le modalità di
isolamento ed altre notizie utili al ricercatore.
Alcune di queste linee sono:
• p-19 , Hela , Huvec , NIH 3T3 , Neuro 2A , PC12, PC3, B16-F1, B16-F10
Condizioni di coltura
• Poichè all’interno dell’organismo esistono specifici sistemi di
controllo che regolano funzioni vitali come nutrizione, controllo del
pH, protezione, mantenimento della temperatura, la coltivazione di
cellule in vitro deve avvenire assicurando il mantenimento delle
stesse condizioni fisico-chimiche, per questo sono fondamentali le
funzioni svolte dal terreno di coltura e dagli strumenti usati per
l’incubazione.
• I parametri fisico-chimici da controllare comprendono:
•
•
•
•
•
- il pH
-La tensione di CO2
-Sistemi tampone
- Temperatura ottimale per la crescita
-La tensione di vapore all’interno dell’incubatore
CONTROLLO TEMPERATURA, TENSIONE DI VAPORE E
% DI CO2