COLTURE CELLULARI
MDA-MB-435
MCF-7
MCF-10
Livelli di organizzazione
LA
Studio delle
FISIOLOGIA
Fisiologia:
funzioni vitali a vari livelli di
complessità
Funzione
(Fisiologia)
Struttura
(Anatomia)
- Livello Molecolare
- Livello Cellulare
- Livello dei tessuti
- Livello di organo
- Livello di Sistemi di organi
- Livello di organismi
- Livello di popolazione
Coltura Cellulare
Abbesi-Impiombato, S 1992. Biochimica Clinica 16(10):957-969
fferenze principale fra In Vivo e In Vitro
Il sistema passa da architettura 3-D a 2-D
In Vitro perde interazione tessuto specifica
Incremento In Vitro di frazione cellulare in crescità
Metabolismo più alto In Vitro
In Vitro perde regolazione sistemica(endocrin & nerv)
Vantaggi di Coltura Cellulare
Controllo di ambiente fisico-chimico
Risposta rapida
Omogenizzazione e caratterizzazione di cellule/tessuto
Svantaggi di Coltura Cellulare
Senza esperienza è difficile
Molte cellule sono necessarie ed il costo è alto
Cellule possono cambiare caratteristiche col tempo
Tipi di colture cellulari
Colture primarie: cellule ottenute direttamente dalla
dissociazione di tessuti
Vantaggio
-Cellule molto simile al tessuto di origine
Svantaggio
-Cellule molto simile al tessuto di origine
-Piccole quantità sono disponibili
-Sterilità è difficile
Colture secondarie: Linee cellulare stabile di cellule
immortalizzate spontaneamente o con virus
-Possono essere cresuite per molte generazioni e in grande
quantità
-Le cellule sono molto simile da esperimento a esperimento
COLTURE PRIMARIE
L'solamento delle cellule da tessuto si può ottenere mediante varie
metodiche, ad es.:
A)
Fluorescence activated cell sorter (FACS)
B)
omogeneizzazione meccanica del tessuto
incubazione in terreno di coltura fino a che si notano gli aloni di
crescita
Tripsinizzazione e piastratura
C)
omogeneizzazione meccanica del tessuto
tripsinizzazione
Dissociazione e piastratura
COLTURA DI TESSUTO
CAMERA GESTAZIONALE
SACCO VITELLINO
CAMERA
GESTAZIONALE
PRELIEVO DI UN
PICCOLO
FRAMMENTO DI
MEMBRANA
FRAMMENTAZIONE DI UN
PICCOLO PEZZO DI CAMERA
PRELIEVO DI
PARTE DELLA
MEMBRANA
FRAMMENTATA
POSIZIONAMENTO DEI
FRAMMENTI IN UNA
CAPSULA PETRI PICCOLA
DISTRIBUZIONE DEI
FRAMMENTI NELLA
CAPSULA PETRI
PICCOLA
POSIZIONAMENTO DEL
VETRINO ROTONDO
ELIMINAZIONE DELLE
BOLLE D’ARIA
AGGIUNTA DEL TERRENO
FIBROBLASTI CRESCIUTI
INTORNO AD UN
FRAMMENTO DI TESSUTO
Coltura di linee cellulari
ADERENTI:
le cellule aderenti solitamente
crescono fino ad occupare l'intera superficie
disponibile (coltura confluente). A confluenza le
cellule devono essere staccate e trasferite in
nuove fiasche (divisione).
IN SOSPENSIONE: in generale crescono in
sospensione le linee di origine emopoietica. La
crescita in sospensione può avvenire in condizioni
statiche o in agitazione (per produrre grandi
quantità di cellule).
Conservazione di linee cellulari
Le cellule da conservare sono staccate dalla piastra mediante
tripsinizzazione, la sospenzione cellulare è centrifugata al fine
di allontanare la tripsina.
Il pellet cellulare è risospeso nello stesso terreno di coltura
utilizzato per la crescita addizionato con ulteriore 10% di siero
fetale bovino inattivato e 10% DMSO 100%, alla
concentrazione di 2x106cells/ml
La sospensione è aliquotata (1ml) in criovials sterili e portata
lentamente alla temperatura di conservazione di –190°C
I batch sono conservati in N2 liquido
Il batch da piastrare è scongelato lentamente a 37°C e
aggiunto al terreno di coltura in fiasca, si incuba a 37°C in
presenza di CO2
Si cambia il terreno per allontanare il DMSO.
Espansione di linee cellulari aderenti
Quando le cellule raggiungono quasi il 100% di confluenza e sono
in buono stato vengono staccate e divise in due aliquote ed
opportunamente ripiastrate in due nuove fiasche
Il monolayer di cellule, dopo 2 lavaggio in PBS sterile, possono
essere staccate mediante:
Tripsinizzazione: si incuba con tripsina (0.25%) per 2-5min a
37°C. Le cellule vengono ulteriormente distaccate dal supporto
manualmente, percuotendo la fiasca e la tripsina viene
neutralizzata mediante aggiunta di terreno di coltura che
contiene siero fetale bovino inattivato. La sospensione cellulare è
divisa in 2 nuove fiasche.
Aggiunta di EDTA 0.04%: si aggiunge EDTA, che chelando il
Ca++ facilita il distacco manuale delle cellule. Dopo aggiunta di
terreno di coltura e centrifugazione a 1000rpm per 5min il pellet
è risospeso in terreno fresco e ripiastrato in 2 nuove fische.
Espansione di linee cellulari in sospensione
Controllare al microscopio che le cellule siano in buona salute
(quando le colture sono troppo concentrate il terreno appare
giallo-arancio)
Contare le cellule e calcolare una divisione tale che la
concentrazione finale sia di 1-2 x 105 cellule/ml, a meno che la
linea non richieda concentrazioni diverse
Se è necessario, trasferire la coltura in fiasche più grandi
Incubare a 36-38°C per 2-3 giorni
Conteggio delle cellule
Il conteggio viene effettuato al microscopio, con l’ausilio di uno
speciale vetrino detto Camera di Bürker
a
b
cells/ml = (a+b+c)/3 x 104
c
Terreni di coltura
Ogni coltura primaria o secondaria cresce in un opportuno terreno di
coltura, i diversi terreni di coltura differiscono tra loro per il contenuto
in aminoacidi e sali, e per la concentrazione di glucosio.
I terreni contengono inoltre rosso fenolo, un indicatore di pH (rossoarancio a pH 7.3, giallo a pH acido e rosso-viola a pH alcalino).
Il sistema tampone utilizzato è il bicarbonato/acido carbonico.
Quest'ultimo deve essere fornito alle cellule in forma di CO2 infatti le
cellule sono incubate in presenza di CO2.
Al terreno usualmente vengono aggiunti:
L-glutamina (aminoacido labile)
Siero fetale bovino (apporta fattori di crescita)
Antibiotici (gentamicina, penicillino/streptomicina, etc.)
Elementi specifici per il tipo di cellule utilizzato, etc.
Preparazione del "cocktail" di coltura
Le cellule vengono coltivate in appositi substrati di coltura, che
possono avere dimensioni differenti.
Ogni substrato è caratterizzato da un valore ottimale di densità
cellulare, e pertanto, una volta determinata la densità della
sospensione iniziale di cellule, si calcola la diluizione da
realizzare per ottenere la densità desiderata.
Piastra
cellule
90mm
6x106
60mm
3x106
20mm
1x106
12pz
5x105
24pz
2.5x105
96pz
8000/15000
Gestione dell'area sterile
La pulizia e la perfetta efficienza dell'area sterile devono
essere controllate costantemente.
Si accede e si lavora indossando i dispositivi di protezione
individuali (camice), i guanti protettivi (da cambiare spesso).
I rifiuti biologici e chimici, solidi e liquidi prodotti nel
laboratorio, devono essere raccolti, separati ed eliminati in modo
corretto.
I piani di lavoro devono essere mantenuti puliti, inoltre occorre
controllare e mantenere la pulizia, il buon funzionamento e
l'efficienza dei vari strumenti (microscopio, pipettatori
automatici, cappe a flusso laminare, incubatori, bagno
termostatato, frigorifero, ecc).
Procedure di sterilizzazione
Tutto il materiale utilizzato per l’isolamento e la coltura delle
cellule deve essere sterile, al fine di evitare contaminazioni di
batteri o muffe che possano danneggiare le colture.
Le soluzioni usate sono preparate con acqua sterilizzata
mediante autoclavaggio e sono quindi filtrate con filtri sterili da
0.2 µm.
Il siero fetale viene inattivato tenendolo a una temperatura di
56°C per 30’ e poi filtrato con filtri sterili da 0.2 µm.
Il materiale di consumo (piastre, tubi da centrifuga, pipette,
filtri, siringhe ecc.) è acquistato direttamente in confezioni
sterili monouso.
La steriltà della cappa è assicurata dall'irraggiamento con raggi
UV, generalmente effettuato per tutta la notte precedente
all’isolamento delle cellule.
Preparazione di estratti proteici da cellule in coltura
Dopo 1 lavaggio con PBS sterile, le cellule vengono staccate dal
supporto dopo aggiunta di un buffer di lisi, RIPA (1% triton X100), al quale vengono aggiunti inibitori di proteasi, mediante
utilizzo di un raschietto,
Le cellule sono ulteriormente rotte mediante sonicazione e la
sospenzione è centrifugata a 10000rpm per 5min.
Si dosano le proteine totali con il micrometodo di Bradford o di
Wadden-Hill.
Le proteine possono essere conservate a –20°C.
Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Pre-trattamento delle Cellule
Un passo importante e spesso ignorato- non è
naturale ma pùo avere un effetto sul resultati
1) Niente
2) Blocco metabolico- stai attento, non bloccare mai
completemente. In differente parte del ciclo
cellulare per iniare tutti le cellule nello stato
identico dello ciclo (sincronizzazione) che pùo
essere utile, per essempio, per un sostanza che
prodotto solamente in un parte del ciclo
Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Citotossicità
Analisi del ciclo
cellulare
Apoptosi
Motilita’/invasione
Test di proliferazione (chemiosensibilità):
Def: Incremento di metabolismo cellulare accompanato da
un aumento in grandeza, numero o entrambe
Trypan Blu Stain
Crystal violet
Test MTT
Cell Proliferation ELISA BrdU
Test citotossico con incorporazione di 3H-Timidina
Citofluorimetria (FCS)
Cell Death Detection ELISA
Camera di Boyden o raschio o infiltrazione
Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Proliferazione
-Incremento di metabolismo che pùo essere in un
aumento di grandezza delle cellule, nel numero
del cellule o entrambe
Statico- contare il numero di erbe in un campo
-Numero di cellule/superficie
Haeomocytometer
Coulter counter
-Misure di essere stanardizato al # cellulare
Colorante specifico ai cellule
Densità opticale
RNA totale
DNA totale
Proteina totale
-Parametri del ciclo cellulare (fase S)
Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Proliferazione
Cinetico- attività delle erbe
-Metabolico
O2consumo/CO2 produzione
MTT o simile
-Organico sintesi
Incorporazione di timidina in DNA
Incorporazione di aminoacidi in proteine
-Produzione di proteine associato alla crescità
Citokeratine
pS2
Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Morte Cellulare
Normalmente si lavora con populazione di cellule
La crescita assoluta non è solamente l’incremento di cellule ma
deve anche includere misure della morte di alcune cellule nella
populazione
Reale crescita cellulare = (l’incremento dello numero di
cellule dovuta alla proliferazione) - (il decremento dello
numero di cellule dovuta alla morte)
Necrosi: cellule si rompano con rilascio del citosol
86Cr
LDH
Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Morte Cellulare
Apoptosi (morte cellulare programmato)
Digestione controllato di DNA nucleare a frammenti di distinti grandeza
da nuclitasi Ca2+-dependente. DNA diventa rotto in subunità di misure
esatta (Scala di DNA) e poi è rilasciata nel citosol
DNA totale o citosolico in un gel
3H-dT or misura chimica in citosol
Anticorpi
Sia necrosi che apoptosi hanno un effetto precoci sulla viabilità
cellulare ed, quindi, il “Tryptan Blue Exclusion Test” è un misura
facile
Trypan Blue Stain e Crystal Violet
Tests di citotossicità
Principio su cui si basa:
Cellule vitali possiedono membrana cellulare selettiva. Cellule morte
perdono la capacità selettiva
Cellule in coltura in piastre opportune
Trattamenti farmacologici
Trypan Blue
Preparazione della sospensione cellulare in PBS
Incubazione per 5’-15’ del campione con la sonda allo 0.4% in PBS
colora selettivamente le cellule morte
Conta cellulare tramite camera di Burker
Valutazione della vitalità cellulare :
(n. cellule vitali/n. cellule totali)X100
Trypan Blue Stain e Crystal Violet
Crystal Violet
Incubazione del campione con la sonda (10 minuti)
colora selettivamente le cellule vive
Lavaggi con dH2O
Una soluzione contenente Na-citrato 0.1M e EtOH scioglie il colorante
Lettura del campione effettuata allo spettrofotometro (540nm)
Semina generalmente effettuata in piastre da 96 pozzetti
Lettura con Plate Reader
Incorporazione di 3H-Timidina
Tests di citotossicità
Principio su cui si basa:
Capacità della cellula di incorporare 3H-Timidina
durante la sintesi del DNA
Cellule in coltura in piastre da 96 pozzi
Incubazione per24h con 3H-Timidina (incorporata al posto della timidina)
Trattamenti farmacologici
Incubazione con miscela scintillante
Lettura tramite TOP COUNT
Cell Proliferation ELISA BrdU
Tests di citotossicità
Principio su cui si basa:
Capacità della cellula di incorporare BrdU durante la sintesi del DNA
Cellule in coltura in piastre da 96 pozzi
Trattamenti farmacologici
Incubazione per2-24h conBrdU (incorporata al posto della timidina)
Tetramethyl
benzidine
Fissaggio e denaturazione
H2SO2 1M
Anti-BrdU-POD
BrdU
450nm
Test MTT
Test di citotossicità
Principio su cui si basa:
Dimethyltiazol-diphenyltetrazolium-bromide
succinato deidrogenasi
formazano
Cellule in coltura in piastre da 96 pozzi
Trattamenti farmacologici
Incubazione
per 30’-1h del campione con la sonda (0.5mg/ml)
a 37°C e 5% CO2
Sonda sciolta con DMSO
Lettura del campione effettuata allo spettrofotometro (570nm-630nm)
Citofluorimetria
FCS permette di:
• analisi quantitativa del contenuto di DNA
• discriminazione di cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare
fasi principali
fase G1
fase S
fase G2
fase M
ciclo cellulare:
sintesi di fattori indispensabili alla crescita
o di sintesi del DNA
preparazione alla mitosi cellulare
o di mitosi
I farmaci producono alterazioni metaboliche su vari livelli
perturbazione del ciclo cellulare
Citofluorimetria
Ioduro di Propidio
Analizza la distribuzione delle cellule con un determinato contenuto di
DNA all’interno del ciclo cellulare
Si intercala nel DNA a doppia elica
Forma un complesso stabile che emette una fluorescenza rossa quando
eccitato con un laser
Eccitazione proporzionale a contenuto di DNA
Citofluorimetria
Cell Death Detection ELISA
Misura dell’apoptosi
Principio su cui si basa:
Determinazione quantitativa dei frammenti di DNA
associati a proteine istioniche dopo induzione dell’apoptosi
Cellule in coltura in piastre da 96 pozzi
Trattamenti farmacologici
Endonucleasi tagliano il DNA a livello degli istioni
I frammenti a doppio filamento passano nel citosol
Lisi della membrana plasmatica
Raccolta del citosol del campione e centrifugazione
Raccolta del sovranatante
Cell Death Detection ELISA
405nm
Tetramethyl
benzidine
Anti-DNA-POD
Mouse Monoclonal Ab
Anti-histone
biotina
streptavidina
Motilità Cellulare/Invasion
Un aspetto importante è il movimento e/o invasione di cellule
Come primo passo cè il stimolo di cambiare forma- si pùo fissare
le cellule in gluteraldehyde, colorare e guardare la tendenza
di cambiare forma
La cellula poi comincia di spostarsi: misuare in camera speciale
BOYDEN CHAMBERS
La substrato messo sul filtro e i sostanze dal altra lato del filtro
sono importante (chemio-attrente)
Invasione non è solamente il movimento ma anche la digestione
del matrice extracellulare per permettersi di attraversarla.
Quindi, l’uso di un matrice che non pùo essere attraversato senza
digestione è una misure del invasione
Molti usano la rilascio di proteasi extra-cellulare come un misure
di invasione.
Motilità Cellulare/Invasion
Misure di Chemotaxis, Haptotaxis e Invasione In Vitro
La differenza fra questi sono il tipo di matrice applicato sul filtro
che separa i due compartimenti della Camera di Boyden
Chemotaxis: semplice gelatina che aiuta l’adesione delle cellule ma
non è una barriera né un’agente stimolante. Le cellule semplicemente
migrano verso un gradiente chimico definito
Haptotaxis:il filtro è coperto di sostanze che non creano una
barrierama stimolano l’adesione e il movimento. Es: fibronectina,
laminina e collagene IV
Invasione: si copre il filtro con un estratto ricostituito di
complesso extracellulare (MATRIGEL) che dà una barriera sia
fisica che chimicache le cellule devono attraversare quando
stimolate da un gradiente chimico
Le macromolecole che costituiscono la
matrice extracellulare sono secrete
localmenete dalle cellule presenti nella
matrice stessa prevalentemente dai
fibroblasti (condroblasti e osteoblasti)
Le due pricipali classi di macromelcole extracellulari che compongono la
matrice sono:
1- Catene polisaccaridiche chiamate GLICOSAMMINOGLICANI (GAG)
che si legano alle proteine a formare i PROTEOGLICANI
2- Proteine fibrose appartenenti a due gruppi:
A- funzione strutturale: COLLAGENO ed ELASTINA
B- funzione adesive: FRIBRONETTINA e LAMININA
Motilità Cellulare/Invasion
Apparatus: Ci sono un numero di possible configurazione che sono in uso per questi
misure: Boyden Chambers, Blind Well Chambers e Multiwell Chambers che sono utilizati
primarimente per chemotassi. Questi sono fatti in tal modo che un filtro pou essere messo
fra due two camera di volume variable e così creare due ambiente separate. Ci sono
anche quelle pre-fatto, mono-uso inserti di filtri coperto che possono essere utilizati per
questi misure che sono prodotti da Costar and Millipore.
I volumi delle due camere possono variare molto; in nostra la camera inferiore
ha 25 µl ed quella superiore fino a 200 µl.
Tecnica di Base : A un lato del filtro agg. cellulle e i sostanze di interesse ( per stimilare o inibire). In
chemotassi e invasione si mette i sostanze della gradiente per produrre movimento più i stimulatori o
inibitori al altro lato del filtro ed incubare per vari tempi (di solito 6 o 24 ore). In haptotaxis il terreno nei
due compartmenti sono identiche in maniere che il stimulo di migrare è nella matrice sul filtro. Alla fine
del incubazione i filtri sono tolti e le cellulle che migrate sono fissati, colorate e contate.
Motilità Cellulare/Invasion
Fixing a nd staining cells: Fix and stain with the “DIFF QUICK” stain k it fr om B AXTER:
At end of incubation remove the filter and put bottom side (ie. cell s that migrated) up on a slide;
three (3) filters to a sli de.
With eye d ropper:
put on fixit ive for - 2-4 minu tes
put on red dye for - 2-4 minutes
put on vio le t dye for - 2-4 minutes
Dip in doubl e distill ed water 2X (in di ffer ent beakers)
Put fi lters on n ew sli de with migrated cell s down this time
Suppo rting the fi lter with end of a small spatula, gently wipe away the cell s that didn’t mi grate with
a soft paper napkin (kleenex) or wet cotton swab
Migrated cell s are count ed at a magnifi cation o f - 160x and th e number of cells mi grated per
microscopic fie ld is a measure of cells capabili ty to cross basement membranes.
Motilità Cellulare/Invasion
Wound Healing (Raschio)
Motilità Cellulare/Invasion
Infiltrazione di cellule tumorali in un monolayer confluente di cellule
normali
Motilità Cellulare/Invasion
Motilità Cellulare/Invasion
STRUTTURE INVASIVE
• Invasione fisiologica degli osteoclasti: PODOSOMI
• Invasione patologica delle cellule metastatiche: INVADOPODI
•F-actina
•Actina
corticale
•Integrine
~1µm
•Proteasi
solubili e di
membrana
FORMAZIONE
ADESIONE
DIGESTIONE
Motilità Cellulare/Invasion
È uno strato sottile
FITC-GEL
Non si può misurare nel tempo l’attività proteolitica
Non permette una esatta co-localizzazione tra NHE1
e la digestione focale
GELATINA+BSA-BODIPY:
proteolisi
La fluorescenza del Bodipy è
quenchata al 95% nella BSA non
digerita
Gelatina contenente BSA
che lega 16 molecole del
fluoroforo BODIPY
Motilità Cellulare/Invasion
DIGESTIONE
FOCALE
(Pixel Density)
30
25
MDA-MB 231
pH 6,88
20
15
10
5
0
pH 7.44
pH 6.88
>1µm
3D Iso-surface
NHE1
GELATINA CON BSA-BODIPY