CORSO DI PERFEZIONAMENTO
NUOVI SVILUPPI nella DIAGNOSTICA
MICROBIOLOGICA e VIROLOGICA
2° Modulo – 22 ottobre 2004
Rosanna Dei
Le colture cellulari in batteriologia
LE COLTURE CELLULARI
Espianti di tessuto
mantenimento e moltiplicazione cellule in
vitro
• Colture primarie-Colture continue
• Cellule normali-Cellule trasformate
• Cellule epiteliali/fibroblasti-Cellule linfoidi
– studio dei virus
– produzione di vaccini
– biologia cellulare
LE COLTURE CELLULARI
• Incubatore a CO2
• Microscopio invertito esame a fresco
• Congelatore a –80oC / azoto liquido
• Manipolazioni in asepsi
• Materiali sterili
LE COLTURE CELLULARI
Dalla fiasca madre, passaggio per
• mantenimento
– cadenza varia a seconda del tipo cellulare
• uso
• stoccaggio
– azoto liquido o -80oC
Disponibilità in commercio
LE COLTURE CELLULARI
Contaminazioni
• Grossolane
– terreno torbido
– cellule sofferenti
batteri, funghi
• Insidiose
– terreno limpido
– cellule non sofferenti
micoplasmi
virus
cellule spurie
LE COLTURE CELLULARI
Contaminazioni da micoplasmi
• 15-20%
• Origine
– pipette a bocca
– terreni e sieri
• Effetto sul metabolismo cellulare
• Controllo di qualità
– controllo delle contaminazioni da parte
di agenti infettanti o da cellule diverse
• coltura
• DNA fluorocromo
LE COLTURE CELLULARI
Precauzioni
colture di cellule animali
virus latenti o non riconosciuti
rischio potenziale
Buona prassi di laboratorio
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Schizomiceti
• autonomi
• parassiti intracellulari facoltativi
• parassiti intracellulari obbligati
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Parassiti obbligati
• coltivazione
Parassiti facoltativi / autonomi
• valutazione di caratteristiche
particolari
• mantenimento di caratteristiche
particolari
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Fattori di virulenza
Fattori di patogenicità
espressione
Test di sensibilità agli antibiotici
Maurin M, Raoult D. Optimum treatment of intracellular infection.
Drugs 1996 Jul;52(1):45-59
• The intracellular location of some micro-organisms has been
early recognised as a critical point to explain failure of
antibiotic therapy to eradicate such pathogens from infected
hosts. Most often parasites invade 'professional' phagocytic
cells, including neutrophils, monocytes and macrophages, by
resisting the intracellular bactericidal phagolysosomal pathway.
Alternatively, they may invade 'non-professional' phagocytic
cells (cells with fewer phagocytic and bactericidal abilities) such
as endothelial cells, or even cells without lysosomes such as
erythrocytes. The intracellular activity of an antibiotic depends
on several factors including its ability to reach the eukaryotic
cell membrane, its subcellular localisation as compared to that
of the parasite, the possibility that the intracellular milieu may
partially inactivate its activity, and the susceptibility of the
intracellular form of the parasite. In vitro and animal models
have been developed to investigate antibiotic activity against
intracellular pathogens. However, it should be emphasised that
only data obtained from patients give reliable information to
define the optimum antibiotic regimen.
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Test di sensibilità agli antibiotici su TC
• Infezione del monostrato cellulare
• Lavaggio abbondante
• Aggiunta terreno addizionato con
l’antibiotico in esame e con gentamicina
• Valutazione CFU a tempi diversi
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
L.pneumophila coltivata o meno in TC
TC
-4o passaggio
8o passaggio
CFU per infettare una cellula
17.5
2.5
1.0
Ripetuti passaggi in TC
• varianti con virulenza maggiore
• capacità minore di crescita su terreno artificiale
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Fattori di virulenza e di patogenicità
• Adesività
• Invasività
• Tossinogenicità
Valutazione su base
• biologica
• immunologica
• genomica
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Valutazione biologica
Animale
• scelta della specie
– neutralizzazione con antisiero
• C.diphteriae in cavia
• Ansa ileale coniglio
• Sereny test in cavia
Colture cellulari
• scelta della linea cellulare
– neutralizzazione con antisiero
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Test di adesività
Test di invasività
• Richiedono un certo impegno
• Aspetti differenti
E.coli adesività
Cellule Hela colorate con Giemsa
localizzata
diffusa
aggregata
LE COLTURE CELLULARI IN BATTERIOLOGIA
Saggi di tossinogenicità
citotossicità
patogeni intestinali
C.difficile citotossicità fecale
• Preparazione cellule
• Preparazione estratto fecale
• Esecuzione test
• Lettura effetto citotossico
C.difficile citotossicità fecale
Preparazione cellule
Linee cellulari di uso comune
– Hela, Hep, Vero, CHO, McCoy, Int 407, MRC-5,…
Preparazione cellule dalla fiasca madre
• Microtiter a 96 pozzetti fondo piatto per TC
– seminati con 200 l di sospensione cellulare in
terreno con Antibiotici
A seconda del tipo cellulare,
• già utilizzabili dopo un paio di ore
• utilizzabili per 3-5 giorni
C.difficile citotossicità fecale
Preparazione estratto fecale
• Sospensione fecale
– 1-4 voll salina a seconda della consistenza
– aliquota direttamente se in Tampone glicerinato
• Vortexare
• Centrifugare
– 3000 macro
– 10000 micro
non occorre separare il sopranatante
C.difficile citotossicità fecale
Esecuzione test
Sopranatante estratti non separato né filtrato
• 50 l al primo di una serie di cinque
pozzetti, mescolare, trasferire 50 l al
secondo, e così fino all’ultimo
• Idem ad una serie di tre pozzetti con siero
neutralizzante (TechLab, diluito 1/10  10 l
pozzetto)
• Incubazione in termostato a CO2
Prevalence of toxin A negative/B positive Cd
strains.J Hosp Infect 1999;42, 248-9.
Cellule McCoy lettura a fresco
estratto fecale Cd pos
estratto fecale + antitox
estratto fecale
Cd pos
Cd neg
controllo
Cd neg
Cd neg
Cellule VERO lettura a fresco
controllo
verotox