TECNICHE DI CARATTERIZZAZIONE DI COMPOSTI
VOLATILI ED AROMATICI IN MATRICI ALIMENTARI
MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA
Massimo Baldizzone
FINALITÀ DELLA RICERCA
CHIMICO
ANALITICO
SVILUPPO METODO
ANALITICO
VALIDAZIONE PRIMARIA
(ISO 17025)
CHIMICO
ENOLOGICO
ALTERNATIVE ALLE
METODICHE IN USO
VARIETÀ
AROMATICA
QUALIFICANTE
GLI AROMI
SONO RAPPRESENTATI DA CENTINAIA DI COMPOSTI A
CONCENTRAZIONE VARIABILE TRA mg/L E ng/L
VARIETÀ
METABOLISMO DELL’UVA
TERRENO
CLIMA
TECNICHE COLTIVAZIONE
FENOMENI BIOCHIMICI
METABOLISMO MICROBICO
REAZIONI CHIMICO – FISICHE ED
ENZIMATICHE
FERMENTAZIONE
POST- FERMENTAZIONE
INVECCHIAMENTO
I COMPOSTI AROMATICI
TERPENI LIBERI
TERPENI GLICOSILATI
 ALDEIDI
 CHETONI
 OSSIDI
MONOSACCARIDI E DISACCARIDI
DEGLI ALCOLI E DEGLI OSSIDI
 ALCOLI MONO, DI,TRI-IDROSSILATI
 IDROCARBURI TERPENICI
 ESTERI
SCARSAMENTE VOLATILI E
OLFATTIVAMENTE NON
AVVERTIBILI
Monoterpene idrocarburico
4
3
CH3
5
2
1
1
2
3
C
CH3 CH2
Limonene
4
5
Alcol monoterpenici
CH3
CH3
CH2OH
H
C
CH3 CH3
Geraniolo
OH
CH2
C
CH3 CH3
Linalolo
Monopreni aldeidici
CH3
CH3
H
CHO
H
C
Geraniale
CHO
C
Nerale
I COMPOSTI AROMATICI
NORISOPRENOIDI
ALCOLI SUPERIORI E POLIALCOLI
ESTERI VOLATILI
FLOREALE
ISTITUTO
SPERIMENTALE DI
ENOLOGIA
FRAZIONE IDROFILA
FRAZIONE LIPOFILA
METODO
SVILUPPATO
UNICA FRAZIONE
FRAZIONE GLICOSILATA
 STRUTTURA PER ESTAZIONE SPE
CONDIZIONI DI ESTRAZIONE NON
RIPRODUCIBILI
CARICO SORBENT
SATURAZIONE SORBENT
NO RECOVERY
 STANDARD INTERNO
DETERMINAZIONE
TRAMITE METODO
AGGIUNTE STANDARD
STANDARD INTERNO
CAMPIONE
Aggiunta std interno
1 eptanolo
Diluizione
Passaggio su colonnina (C18)
Frazione lipofila
LIBERI
Frazione idrofila
GLICOSILATI
Adsorbiti su cartuccia
Non trattenuti
IDROFILI
AGGIUNTA STANDARD
1 PENTANOLO
AGGIUNTA DICLOROMETANO
ESTRAZIONE LIQUIDO - LIQUIDO
RECUPERO FASE ORGANICA
DISIDRATAZIONE TRAMITE
SOLFATO DI SODIO
CONCENTRAZIONE A PICCOLO VOLUME
INIEZIONE GC- MS
splitless
COMPOSTI ADSORBITI SU C18
ESTRAZIONE CON CH2Cl2
ELUIZIONE LIPOFILI
CONCENTRAZIONE
COME PER IDROFILI
INIEZIONE GC- MS
Splitless
COMPOSTI NON ELUITI CON CH2Cl2
ELUIZIONE CON METANOLO
CONCENTRAZIONE
CATALISI ENZIMATICA
ELIMINAZIONE SEDIMENTI
TRAMITE
CENTRIFUGA
AGGIUNTA STD
1 EPTANOLO
PASSAGGIO SU C18
I TERPENOLI SONO TRATTENUTI
ELUIZIONE CON DICLOROMETANO E TRATTAMENTO COME PER LE ALTRE FRAZIONI
ATTIVITA’CATALITICA AR 2000
O
OH
Terpene glicosilato:
R
CH2
CH2
O
O
R
CH2OH
O
Glucoside:
O
OH OH
OH
Glucoside
R-OH
O
OH
OH
OH OH
Terpene glucoside
OH
STUDIO DEL PROBLEMA ANALITICO
 TIPOLOGIA DEGLI ANALITI RICERCATI
•CLASSI CHIMICHE DIFFERENTI
•PROPRIETÀ CHIMICO - FISICHE NON OMOGENEE
 LIVELLI DI CONCENTRAZIONE ATTESI
•CONCENTRAZIONE VARIABILE: DA ng/L A mg/L
 CARATTERISTICHE DELLA MATRICE
•MATRICE COMPLESSA
STUDIO DEL PROBLEMA ANALITICO
ATTENZIONE ALLE FASI DI CAMPIONAMENTO E DI
TRATTAMENTO DEL CAMPIONE
VALUTAZIONE DELLE TECNICHE DI CAMPIONE E DI CLEAN-UP
Campione
(10,0mL)
Diluizione in H2O (1:25)
Estrazione SPE
Lavaggio interferenti
(10,0mL H20)
Eluizione analiti
(10,0mL CH2Cl2)
Standard Interno
(1-Eptanolo 400μgL-1)
Preconcentrazione
(Vf: 400μL)
GC-MS
(Vinj=1,0μL in modalità splitless)
EFFETTO MATRICE
TECNICHE DI
CALIBRAZIONE
CALIBRAZIONE
ESTERNA
NO CALIBRAZIONE
ESTERNA
STANDARD
INTERNO
ADDIZIONE
STANDARD
• 27 STANDARD TRA TERPENI ALCOLI ED ESTERI
• ADDIZIONI STANDARD AD UN CAMPIONE A 4
LIVELLI DI CONCENTRAZIONE
Livelli di [ ] in µgL-1
1. 0,0 µgL-1
2. 100,0 µgL-1
3. 200,0 µgL-1
4. 500,0 µgL-1
MODELLO DEL PRIMO ORDINE: Y = B0 + B1X
È STATO VERIFICATO COME LA DILUIZIONE ABBIA
RIDOTTO L’EFFETTO SULLA PENDENZA AD UN VALORE
NELL’ORDINE DELLA VARIABILITÀ DEL SISTEMA
SI È UTILIZZATO IL MODELLO CALCOLATO PER OGNI ANALITA
CON L’ADDIZIONE STANDARD COME CALIBRAZIONE PER LA
DETERMINAZIONE DEI COMPOSTI CONSIDERATI IN 18
BRACHETTI RAPPRESENTATIVI DELLA ZONA DI PROBUZIONE
Y = B0 + B1X
Y = B1X
“IN HOUSE” VALIDATION
(single-laboratory method validation)
 ASSICURARE L’ATTUABILITÀ DEL METODO PRIMA DI EFFETTUARE UNO
STUDIO INTER LABORATORIO
 FORNIRE EVIDENZA DELL’AFFIDABILITÀ DEL METODO ANALITICO NELLE
CONDIZIONI OPERATIVE PROPOSTE
PARAMETRI DI QUALITÀ DEL METODO :
RANGE DINAMICO LINEARE
ACCURATEZZA E PRECISIONE
SELETTIVITÀ E SPECIFICITÀ
LIMITE DI RILEVABILITÀ (LOD)
LIMITE DI QUANTIFICAZIONE (LOQ)
RECUPERO
INTERVALLO DINAMICO E
INTERVALLO LINEARE
INTERVALLO DINAMICO DI LINEARITÀ: INTERVALLO MASSIMO PER IL QUALE
È SODDISFATTA LA RELAZIONE Y= B0+B1X
0,0 – 500,0 µg/L
R2 = 0,987
INTERVALLO DI LINEARITÀ:
0,0 – 1000,0 µg/L
R2 = 0,767
RECOVERY SUL SORBENT
500,0 µg/L
STANDARD INTERNO
1- EPTANOLO
35%- 70%
ERRORI CASUALI IN FASE DI
PRECONCENTRAZIONE
GC-MS STATION
Condizioni operative GC-MS
 Colonna polare tipo INNOVAX.
lunghezza 30 m, i.d. 0,25.
 Gas di trasporto:He.
 Tipo di iniezione: splitless.
apertura valvola dopo 2 minuti.
 Tempo di corsa: 93 minuti.
Rate
°C/min
Final
temp
°C
Final
Time
Min
Level 1
42
60
2.00
Level 2
2.0
190
2.00
Level 3
5.0
230
15.00
Composto
Range di
concentrazione
nei brachetti in
μgL-1
LOD
μgL-1
LOQ
μgL-1
5,898
Acido butanoico, 2 metil estere
Nr-65
13 ± 0,7
51 ± 2,3
6,083
Acido butanoico, 3 metil estere
Nr-239
15 ± 0,7
46 ± 2,3
7,266
1 butanolo, 3 metil acetato
257- 777
7± 0,3
21 ± 1,1
8,803
Alfa Terpinene
297-712
31 ± 2
95 ± 6,1
9,637
Acido esanoico etil estere
386-737
14 ± 0,7
43 ± 2,2
10,680
Gamma Terpinene
Nd-180
32 ± 1,6
94 ± 4,75
12,030
Acido acetico, esil estere
1268-5873
158 ± 8
290 ± 14,5
14,863
Acido eptanoico, etil estere
727-1058
14 ± 1
43 ± 2,6
370-1058
14 ± 0,57
42 ± 1,75
Ret.
Time
Min.
15,039
Acido propanoico, 2-idrossi, etil estere
15,558
1 esanolo
Nd
Nd
Nd
15,590
3 etossi,1 propanolo
266-580
7 ± 0,2
22 ± 0,65
17,070
3 esen-1-olo
Nr-500
8 ± 0,26
24 ± 1,37
19,800
Acido ottanoico etil estere
466-780
9 ± 0,45
27 ± 1,35
21,285
3 metil,1 butil pentoato?
Nd
Nd
Nd
21,611
Cis linalolo ossido
232 - 400
23 ± 1,2
68 ± 3,80
25,647
Acido nonanoico, etil estere
76-480
12 ± 0,76
36 ± 2,28
26,000
Linalolo
90-276
11 ± 0,38
34 ± 2,15
27,088
5 metil, 2 Furancarbossialdeide
Nr-341
47 ± 2,04
142 ± 6,51
30,408
2 Decanolo
551-1024
7 ± 0,44
21 ± 1,23
31,153
Acido decanoico etil estere
198-396
16 ± 0,99
49 ± 3,05
33,308
Acido butandioico dietil estere
Nd
Nd
Nd
34,408
Alfa Terpineolo
56 - 466
6 ± 0,25
19 ± 1,18
34,509
Gamma Terpineolo
Nr - 400
63 ± 5,68
190 ± 17,1
38,669
Beta Citronellolo
Nr - 483
4 ± 0,14
13 ± 0,48
40,238
Nerolo
Nr - 540
9 ± 0,7
29 ± 2,38
42,581
Alfa Ionone
Nr - 535
10 ± 0,87
32 ± 2,80
42,764
Geraniolo
Nr - 493
6 ± 0,49
18 ± 1,47
Nr: Non rilevabile
Nd: Non determinato