CELI TEST
TEST PER LA RILEVAZIONE NEL
SANGUE ( E NEL SIERO) DEGLI
ANTICORPI DI TIPO IGA CONTRO
LA TRASGLUTAMINASI E LA
GLIADINA
(SANGUE/SIERO)
METODICA
7. Raccolta e preparazione del campione
Raccolta del campione
Il test è stato progettato per l’uso di campioni di sangue fresco, non
emolizzato. Il kit include micropipette per raccogliere il campione da
gocce di sangue.
Il test Celiachia tTG & Gliadina può essere usato con campioni di
plasma o siero
Trasporto e conservazione del campione
I campioni possono essere conservati in frigorifero per un giorno.
REF C-96
10 test
1. Uso previsto
La malattia celiaca (CD) è un’enteropatia umana causata da una
permanente intolleranza al glutine e, più specificamente, ad una sua
frazione proteica, chiamata gliadina. Nelle persone geneticamente
predisposte, l’ingestione di questa proteina comporta serie lesioni della
mucosa intestinale, caratterizzata istologicamente da una iperplasia delle
cripte con atrofia totale o subtotale dei villi intestinali. Una diagnosi
definitiva della celiachia è basata sui caratteristici mutamenti istologici
osservabili nelle biopsie intestinali. In ogni caso, test sierologici come il
rilevamento di anticorpi anti-gliadina, anti-tTG ed anticorpi antiendomisio,
rappresentano il metodo di analisi più economico e meno invasivo per
l’identificazione di questa malattia. Il test Celiachia tTG & Gliadina è un
test immunocromatografico progettato per rilevare nel sangue gli anticorpi
del tipo lgA contro la transglutaminasi (tTG) del tessuto umano, il principale
autoantigene riconosciuto dagli anticorpi anti-endomisiol e dagli anticorpi
contro le gliadine. Il suo uso è particolarmente indicato nel caso di pazienti
pediatrici (fino ai 16 anni).
2. Introduzione e/o significati clinici
La malattia celiaca è un disturbo autoimmune che causa la reazione del
glutine, una proteina che si trova in prodotti derivati da grano, orzo, segale
ed avena, una volta a contatto con i rivestimenti intestinali, causando danni
ed impedendo il normale assorbimento del cibo. In alcuni casi leggeri la
diagnosi potrebbe risultare difficoltosa, ma in casi gravi si possono
verificare condizioni di evidente malnutrizione (ritardo nella crescita e
difficoltà ad aumentare di peso nei bambini, perdita di peso negli adulti) e di
malassorbimento (cattivo odore, apparenza grassa e galleggiamento degli
escrementi, diarrea).
8. Procedura del test
1. Lasciare che il dispositivo reattivo raggiunga la temperatura ambiente
prima di aprirlo. Allo stesso modo, lasciare che il buffer di diluizione
raggiunga la temperatura ambiente.
2. Rimuovere il dispositivo reattivo dall’involucro e posizionarlo su un
tavolo o su una superficie orizzontale.
3. Campioni: campione di sangue (3.1) e campione di siero (3.2)
3.1. Campione di sangue
3.1.1 Prelievo del campione di sangue.
Il sangue deve essere prelevato dalla punta del dito, usando il dito indice,
medio o anulare. Pulire l’estremità del dito con l’alcol e lasciarla
asciugare. Disporre la mano con il palmo rivolto verso l’alto e pungere il
dito con una NUOVA lancetta sterile.
Esecuzione:
1. Premere la protezione gialla verso l’interno della lancetta fino a sentire
un click.
2. Ruotare la protezione per romperla ed in seguito estrarla, liberando la
punta della lancetta.
3. Posizionare la punta della lancetta sul dito e premere la levetta di
attivazione in alto.
4. Gettare la lancetta in un contenitore adatto per oggetti affilati.
1
3. Principio del test
Gli anticorpi di tipo lgA presenti nel sangue dei pazienti affetti da celiachia,
tra i quali quelli che agiscono contro la transglutaminasi dei tessuti (tTG) e
le gliadine, reagiscono con le particelle di lattice coniugate con anticorpi
anti lgA. Questi complessi, formati da particelle colloidali/anti -lgA e
anticorpi/lgA si spostano attraverso un processo cromatografico verso la
zona reattiva. In quest’area, vi sono sia ricombinante umano tTG che
gliadine di frumento, che reagiscono con i complessi di particelle colloidali/
anti-lgA/anticorpi/anti-tTG lgA nel primo caso e con i complessi di particelle
colloidali/anti-lgA anticorpi/antigliadina lgA nel secondo caso. Entrambe le
reazioni producono linee rosso/rosa.
2
4. Reagenti e materiali forniti

10 test a card Celiachia tTG & Gliadina

10 lancette sterili

10 pipette per la raccolta

1 tampone di diluzione
3
5. Conservazione e stabilità
Il test Celiachia tTG & Gliadina va conservato a 4°C. La data di scadenza
è stampata sulla confezione.
6. Avvertenze e precauzioni
Utilizzare tutti i reagenti solo in vitro .
I campioni dei pazienti (sangue) possono contenere agenti infetti e
dovrebbero essere trattati e smaltiti come materiali biologici
potenzialmente pericolosi.
Non scambiare componenti da kit con diversi numeri di lotto.
Prima dell’uso, lasciare che tutti i componenti del kit ed i campioni
raggiungano temperatura ambiente, in quanto i campioni e/o i reagenti
ancora freddi possono ridurre l’efficacia del test. Sono solitamente
sufficienti 20-30 minuti per raggiungere temperatura ambiente.
Non usare componenti del kit dopo la data di scadenza.
Se la confezione è rotta, il prodotto può ancora essere utilizzato a patto
che le componenti non siano state danneggiate.
E`importante aggiungere la corretta quantità di sangue in ogni test. Se
messo in quantità inferiore a quella indicata, la cromatografia potrebbe
non verificarsi in quanto il campione potrebbe non raggiungere la zona
reattiva; se messo in quantità maggiore , il reagente potrebbe essere
diluito e produrre una linea tenue.
Il prodotto utilizzato deve essere smaltito secondo quanto stabilito dalla
legge vigente.
Non usare il test nel caso in cui appaia prima dell’utilizzo una linea
colorata nella zona del risultato.
3.1.2 Aggiungere il campione di sangue.
3.1.2.a) Per il prelievo del sangue con la micropipetta inclusa nel kit:
Tenere il dito più in basso rispetto al gomito e premere sulla punta
diverse volte, delicatamente e a intermittenza. Non usare la prima
goccia di sangue (pulirla con una garza sterile o con cotone).
Raccogliere la successiva goccia di sangue con una micropipetta
nuov a. Per fare ciò, toccare la goccia di sangue con la micropipetta
lasciando libero il foro di ventilazione. Non premere sulla parte
centrale della pipetta, consentendo al sangue di risalire per la
capillarità.
Riempire la micropipetta fino alla linea, evitando bolle d’aria.
Porre immediatamente il campione di sangue nel dispositivo reattivo.
Posizionare con cautela la micropipetta al centro del pozzetto
segnalato con una freccia (pozzetto per l’aggiunta del campione), poi
coprire il foro di ventilazione della pipetta con un dito e premere
delicatamente la parte superiore della pipetta.
Nota: Il prelievo ed il posizionamento del campione sul test devono
essere effettuati rapidamente per prevenire la coagulazione del sangue
all’interno della pipetta.
Attendere 30-60 secondi, fino a che il sangue sia assorbito; poi
(tenendo il dosatore in posizione verticale) aggiungere due gocce,
goccia a goccia, o 100 microlitri di tampone di diluizione nello stesso
pozzetto.
Controllare il risultato dopo 10 minuti.
3.2.2.b) Quando il kit di micropipette non è usato: Inserire con
attenzione 15 microlitri di sangue al centro del pozzetto marcato con
una freccia (pozzetto per l’aggiunta del campione).
Attendere 30-60 secondi, fino a che il sangue sia assorbito; poi
(tenendo il dosatore in posizione verticale) aggiungere due gocce,
goccia a goccia, o 100 microlitri di tampone di diluizione nello stesso
pozzetto.
Non valido
Non valido
Non valido
Non valido
10. Limiti
Questo è un test qualitativo; quando il risultato è riportato, non devono
essere fatte interpretazioni quantitative in riferimento all’intensità della
linea indicante la positività.
I risultati del test vanno utilizzati in combinazione con altre informazioni
disponibili dalla valutazione clinica del paziente e da altre procedure
diagnostiche.
È importante aggiungere la corretta quantità di sangue.
È importante controllare il tempo di reazione. Se il tempo di reazione è
inferiore rispetto a quello indicato, i campioni che contengono una
quantità di anticorpi più alta del limite di sensibilità possono essere visti
chiaramente, ma quelli che sono al limite non compariranno. Se il tempo
di reazione è più lungo di quanto indicato, la sensiblità del test verrà
alterata e potrebbero risultare interpretazioni errate.
11. Performance
Controllare il risultato dopo 10 minuti.
3.2. Campione di siero.
Sensiblità e specificità
1. Preparare una diluzione di 1/30 del siero nel tampone di diluizione
Celiachia tTG & Gliadina. Ad esempio 5 l di siero +145 l di
tampone. Mescolare bene agitando delicatamente con la pipetta.
2. Aggiungere con attenzione 125 l della diluizione, goccia a goccia,
al centro del pozzetto.
3. Controllare il risultato dopo 10 minuti.
9. Interpretazione dei risultati
NEGATIVO: Appare una singola linea verticale BLU in mezzo al dispositivo
reattivo, allineata con la lettera “C” (Controllo) presente sulla cassetta del
test. Questa linea deve apparire sempre.
POSITIVO: Vicino alla linea di controllo BLU compaiono una/due linee
ROSSO/ROSA nella zona centrale del dispositivo reattivo, allineata con le
lettere “T1” e “T2” che compaiono sulla cassetta del test. Il colore varierà di
intensità in relazione alla concentrazione di anticorpi presenti.
Il test risulta NON VALIDO se la linea blu non appare, in quanto la
procedura potrebbe non essere stata seguita correttamente, i reagenti
potrebbero essere risultati deteriorati o potrebbe essere stat o aggiunto un
errato quantitativo di campione. Effettuare nuovamente il test.
Valutazione N. 1: Sensibilità e specificità del test Celiachia tTG & Gliadina
con ELISA anti-tTG e anti -gliadine IgAs (Eurospital Eu-tTG IgA; Gliatest S
IgA Chromo) sono state determinate dall’analisi di 157 campioni (sangue e
rispettivi sieri) da pazienti CD (diagnosticati sia nel caso seguissero una
dieta priva di glutine sia no, con l’aggiunta di pazienti diagnosticati di
recente), parenti di pazienti con CD epazienti con sintomi gastrointestinali
(diarrea, malnutrizione, dolore addominale e così via). I risultati sono
presentati nella tabella sottostante:
ELISA tTG
Pos
ELISA IgA
Pos
Neg
Celiachia tTG &
Positivo
26
6
6
4
Gliadina Test
Negativo
4*
121
14
133
(intero campione)
Celiachia tTG &
Positivo
18
6
3
4
Gliadina Test
Negativo
2
66
3
91
(<16 anni)
*I quattro campioni erano inoltre negativi al test Alphadia
Immunodot Gliadin-tTG test.
Concordanza %
Concordanza
di sensitività
%
Concordanza
di specificità
%
Intero
tTG
campione
Gliadina
93.6%
86.7%
95.3%
88.5%
30%
97%
Sotto i 16 tTG
anni
Gliadina
91.3%
90%
92%
93%
50%
98.8%
Qualsiasi linea che appaia dopo 10 minuti a causa della natura del
campione non ha valore diagnostico.
La diagnosi finale non deve essere basata solo sul risultato di un solo test
ma andrebbe stabilita in correlazione ai risultati del test con altri dati
appropriati e con i sintomi clinici.
Neg
Commenti:
I valori anit-gliadina lgA erano molto bassi in tutti i casi, a causa dell’origine
della popolazione e domande dietarie. Quuesto è il motivo per cui è stata
ottenuta una sensibilità più bassa per le gliadine rispetto alle altre
valutazioni.
Negativo
Positivo
Gliad /tTG
Positivo
tTG
Positivo
Gliadine
Valutazione N. 2: La sensibilità e la specificità del test Celiachia tTG &
Gliadina sono state valutate con campioni di sangue provenienti da 123
pazienti, che avevano ricevuto biopsie intestinali a scopo diagnostico in
varie unità di Pediatria Gastroenterologica, in uno studio di prospettiva
poprtato avanti sotto la direzione del Dr. Carmen Ribes Koninckx (La Fe
children's hospital, a Valencia).
I marcatori sierologici per la malattia celiaca sono stati determinati
simultaneamente con il test Celiachia tTG & Gliadina ed ELISA
convenzionali. Sono stati inclusi un totale di 150 pazienti, 26 con una
normale istologia 8 controlli), più 124 con 3 lesioni Marsh e 2 con lesioni
Marsh 2 8 pazienti con CD).
I risultati sono presentati nella tabella di sotto:
Pazienti con malattia celiaca
Concordanza Celiachia tTG & Gliadina tTG/ELISA = 92%.
Concordanza Celiachia tTG & Gliadina /ELISA = 67%.
CD-tTG
ELISA
+
(112)
(12)
+
(114)
108
6
- (10 )
4
6
CD-Gliad
ELISA
+
(72)
(52)
+
(105)
68
37
(19)
4
15
Pazienti di controllo
Concordanza Celiachia tTG & Gliadina tTG /ELISA = 73%.
Concordanza Celiachia tTG & Gliadina /ELISA = 56%.
CD-tTG
ELISA
CD-Gliad
+
(2)
(24)
+
(5)
0
5
(21)
2
19
+
(5)
(20)
+
(15)
4
11
(10)
1
9
ELISA
L’efficacia dei different i metodi nella diagnosi di CD è presentata nella
tabella di sotto.
Sensibilità
Specificità
Efficacia
Celiachia tTG &
Gliadina
90%
89%
90%
Celiachia tTG &
Gliadina
58%
80%
62%
91,9%
80%
90%
76%
49%
70.5%
tTG-IgA (EIA)
AAG IgA (ELISA)
Valutazione N. 3: Concordanza sensibilità/specificità per Celiachia tTG &
Gliadina e Eurospital anti-tTG e anti-gliadin IgA ELISAs (EU-tTG IgA e
Gliatest S IgA Chromo) sono stati valutati con 205 campioni di sangue
prelevati dalla punta del dito. I test ELISA sono stati eseguiti su campioni di
siero ottenuti da campioni di sangue prelevati dalle estremità delle dita e
raccolti con ilSarstedt Microvette CB300 (con EDTA).
I risultati sono stati presentati nella tabella di sotto :
Eurospital ELISA
Celiachi
a tTG &
Gliadina
Positivo (4)
Negativo (200)
Positivo (3)
3
0
Negativo (201)
1
200
Concordanza di sensibilità: 75% (risultato in conclusivo, pochi
campioni).
Concordanza di specificità: 100%
EFFETTO GANCIO
L’effetto gancio è l’effetto prodotto quando, in presenza di alte
concentrazioni dell’analita da individuare, si verifica una diminuzione del
segnale ottenuto, con la estrema possibilità che campioni positivi risultino
negativi. In questo modo, ad un campione con un’alta concetrazione può
essere assegnata una quantificazione molto inferiore alla realtà, o
addirittura un valore negativo.
Numerosi campioni di sangue/siero sono stati testati con il test Celiachia
tTG & Gliadina, con un differente contenuto totale in lgA anti-gliadina e/o
anti-tTG, senza che alcuna inibizione del segnale positivo sia stata
osservata in alcuno dei casi. Di conseguenza nessun effetto gancio è stato
osservato.
Va inoltre segnalato che l’inibizione del segnale positivo basata sul
contenuto totale del siero lgA è stata in effetti osservata. Questo a causa di
competizione tra lgA specifici e non specifici per il legame con il colloide.
Nei campioni di sangue/siero dove il contenuto totale di lgA è basso (come
accade nei campioni dei pazienti pediatrici), non si osserva nessuna
competizione perché il colloide è in grado di catturare tutte le
immunoglobuline. Comunque, quanto il contenuto di lgA è elevato, il
colloide non è in grado di catturarle tutte quante; il segnale positivo può
diminuire (o anche scomparire del tutto), a seconda di quanti specifici lgA si
leghino al colloide.
SOSTANZE INTERFERENTI
Con un lotto di Celiachia tTG & Gliadina, sono state studiate numerose
sostanze che potrebbero essere presenti nel sangue. Le sostanze
interferenti sono aggiunte al tampone nella quantità mostrata nella tabella
ed è effettuata una curva di sensibilità. Due controlli negativi di siero sono
studiati.
Sostanza
Concentrazione
iniziale
Diluente
Concentrazione
nel buffer
Aspirin a
50 mg/ml
Etanolo
2,5 mg/ml
Caffeina
10 mg/ml
Acqua
0,5 mg/ml
Ibuprofene
8 mg/ml
Acqua
0,4 mg/ml
Etanolo
500 mg/ml
Acqua
50 mg/ml
Acido folico
0,4 mg/ml
Acqua
0,02 mg/ml
Acido nicotinico
20 mg/ml
Acqua
1 mg/ml
Emoglobina
15 mg/ml
Acqua
0,75 mg/ml
hCG
250000 mUI/ml
Acqua
500 mUI/ml
EDTA
20 mg/ml
Acqua
1 mg/ml
Citrato di sodio
0,2 M
Acqua
0,01 M
Eparina
500 mg/ml
Acqua
50 mg/ml
Nessuna delle sostanze studiate influisce sulla corretta performance del
test.
Eurospital ELISA
Celiachia
tTG &
Gliadina
PRECISIONE INTER-LOTTO
Con 3 lotti del test Celiachia tTG & Gliadina, è stata eseguita una curva di
sensibilità (diluzioni seriali con un siero di controllo positivo). Le analisi
sono state eseguite dallo stesso tecnico, ottenendo risultati simili con tutti e
tre i lotti, il che dimostra l’alta precisione inter-lotto del test Celiachia tTG &
Gliadina
Positivo (1)
Negativo (201)
Positivo (3)
1
2
Negativo (199)
0
199
Concordanza di sensibilità: 100% (risultato inconclusivo, pochi
campioni).
Concordanza di specificità: 99%
RIPETIBILITA’
PRECISIONE INTRA-SAGGIO
Con 1 lotto del test Celiachia tTG & Gliadina, sono state effettuate 10
curve di sensitività (diluizioni seriali di un siero di controllo positivo). Le
analisi sono state eseguite dalla stessa persona nello stesso giorno. I
risultati ottenuti in tutte le curve erano simili, il che dimostra la precisione
intra-saggio del test Celiachia tTG & Gliadina.
RIPRODUCIBILITA’
PRECISIONE INTER-DAY
Con 1 lotto del test Celiachia tTG & Gliadina, è stata eseguita una curva
di sensibilità (diluzioni seriali con un siero di controllo positivo) è stata
eseguita per 10 giorni consecutivi. Le analisi sono state eseguite dalla
stessa persona, ottenendo risultati simili ogni giorno, il che dimostra l’alta
precisione inter-day del test Celiachia tTG & Gliadina .
PRECISIONE INTER-LABORATOROI
Con 1 lotto del test Celiachia tTG & Gliadina , sono state eseguite 3 curve
di sensibilità (diluzioni seriali con un siero di controllo positivo). Le analisi
sono state eseguite da tre tecnici nello stesso giorno. I risultati ottenuti nei
tre giorni sono stati simili, che dimostra l’alta precisione intra saggio del
Celiachia tTG & Gliadina.
12. Bibliografia
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transglutaminase by calcium and GTP”. The Journal of Biological
Chemistry (1998) 273 (4): 2288-2295.
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