Liquido cefalorachidiano
• E’ un liquido biologico prezioso dal punto
di vista laboratoristico
• - prelevabile in quantità limitate e con
minore frequenza rispetto a sangue ed
urine
• -prelevato con una manovra invasiva
Pertanto:
• - Richiede una maggiore attenzione sia da
parte del neurologo che da parte del
laboratorista:
• A. decisione preliminare degli esami da
richiedere, che influenza a sua volta
• B. la quantità di liquido prelevato e
• C. le modalità di raccolta e conservazione
del campione
Proteine liquorali
Concentrazione 0.5-1% rispetto al plasma
Nel liquor lombare l’ 80% di proteine è di origine plasmatica
ed il 20% è prodotto localmente
Il liquor ventricolare ha una ridotta concentrazione proteica
per ridotto apporto della componente plasmatica
La concentrazione liquorale di proteine dipende da:
•
•
•
•
Concentrazione plasmatica
Sintesi intratecale
Alterazioni del flusso liquorale
Stato della barriera ematoencefalica
Liquor: EBM ?

Numerosi test proposti
pratica
pochi test nella

Molti studi condotti su base retrospettiva e in
piccola scala, con popolazioni di pazienti
preselezionate

Valutazione della sensibilità e specificità
problematiche
Esame del Liquor





Meningiti e
meningoencefaliti:
urgente
Sclerosi Multipla e
enecefalomieliti
demielinizzanti
Poliradicolonevriti
disimmuni
Carcinomatosi meningea
Malattia di CreutzfeldtJacob






Interessamento neurologico
in malattie infiammatorie
/autoimmuni sistemiche
Pseudotumor cerebri
Emorragia subaracnoidea
non definibile tramite TC
Blocco del flusso liquorale
Malattia di Alzheimer ?
Oto/rino liquorrea
La transferrina beta2 è attualmente considerata il
miglior marker per mettere in evidenza la presenza di
liquor nelle secrezioni nasali
IEF transferrina
1-4 sieri normali
5 siero di paz. con
patologia SNC
6 liquor
7 rinorrea di origine
liquorale
1 2 3 4 5 6 7
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
PROCEDIMENTI PREANALITICI
La puntura lombare è di norma effettuata al mattino, con paziente a digiuno.
L’effettuazione in orari diversi, per motivi di urgenza o di opportunità, è segnalata sul referto.
L’utilizzo del campione liquorale (tipologia degli esami richiesti, aliquote conseguenti, modalità
di invio a centri esterni e di conservazione per utilizzi differiti etc.) andrebbe concordato
preventivamente tra clinico e laboratorista.
Il liquor è raccolto in provette sterili in vetro siliconato o polipropilene, evitando quelle in vetro (i
monociti vi aderiscono)
Sarebbe opportuno che il volume di liquor estratto fosse standardizzato (4-5 mL) e che le
aliquote di liquor fossero effettuate da una provetta di raccolta unica:
i) Il gradiente di concentrazione causa differenze in contenuto proteico
tra il primo millilitro di liquor prelevato e gli ultimi millilitri
ii) Aliquotare da un’unica provetta minimizza una possibile fonte di
errore
preanalitico e permette di raccogliere il massimo numero di cellule liquorali
(centrifugazione e recupero del pellet da utilizzare per citocentrifuga o camera di
sedimentazione) da destinare a scopi diagnostici o di ricerca. Per liquor destinati ad
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
PROCEDIMENTI PREANALITICI
Un prelievo di sangue deve essere sempre effettuato contestualmente alla
puntura lombare.
I campioni appaiati di sangue e liquor sono da inviare al più presto in
laboratorio. Gli ospedali o enti esterni al laboratorio dovrebbero organizzare
l’invio dei campioni in tempi brevi, preferibilmente facendo in modo da
recapitarli entro due ore dai prelievi, senza congelare.
Puntura lombare traumatica e sospetto di emorragia subaracnoidea:
i) Si raccomanda la raccolta del liquor in tre provette consecutive.
ii) Le determinazioni si effettuano sulla terza, la meno inquinata in
caso di puntura traumatica.
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
PROCEDIMENTI ANALITICI
Valutazione visiva e analisi spettrofotometrica
Il campione liquorale deve essere valutato per aspetto e colore prima e dopo centrifugazione:
10 minuti a un numero moderato di giri (1500- 3000 rpm, circa 500 g).
Si raccomanda di usare scale qualitative di valutazione per l’aspetto e per il colore (ad esempio,
“limpido”, “sublimpido”, “torbido” per l’aspetto e “incolore”, “xantocromico”, “eritrocromico” per il
colore).
La spettrofotometria andrebbe effettuata solo nel sospetto di emorragia subaracnoidea .
I picchi tipici delle proteine (415 e 460 nm) sono indicativi di danno della barriera
emato-liquorale.
I picchi dei prodotti di degradazione dell’emoglobina (ossi- e meta-Hb: 415, 540 e 580
nm, metaboliti precoci che persistono per 4-8 giorni; bilirubina e composti
bilirubinici:350, 400 e 460 nm, metaboliti tardivi che persistono per 15-20 giorni)
segnalano un’emorragia subaracnoidea recente o pregressa.
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
Cellule liquorali
La lettura delle cellule liquorali è da effettuare entro due ore dalla puntura
lombare.
Dal liquor centrifugato si ottiene un pellet cellulare da destinare all’eventuale
analisi mediante citocentrifuga o camera di sedimentazione.
L’analisi morfologica di base delle cellule liquorali è effettuata colorando con
il May-Grünwald-Giemsa.
L’analisi morfologica delle cellule liquorali è obbligatoria nel sospetto di
carcinomatosi meningea. È inoltre effettuata quando sussista un’indicazione
clinica
Si segnala l’opportunità, nel sospetto di criptococcosi cerebrale, di effettuare
una semplice colorazione (India ink) in grado di mettere in evidenza il
criptococco
Le cellule del liquor
Le cellule nel liquor sono in un ambiente ostile a
causa della bassa concentrazione di proteine che
ne altera la stabilità di membrana
entro un’ora
Camera di conta
Centrifuga
Risospensione in siero
Risospensione del pellet in
una goccia di formaldeide 5%
Citocentrifuga
Colorazione
(MG-Giemsa)
Le cellule del liquor
Linfoblasti in meningosi leucemica
www.aini.it
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
Esame biochimico
L’esame biochimico si effettua su surnatante di liquor centrifugato
Le determinazioni, di norma, sono da effettuate su campioni appaiati di siero e liquor.
Analiti di base (glucosio, albumina, IgG).
Il glucosio deve essere determinato in campioni appaiati di siero e liquor,
esprimendone il rapporto percentuale (glucosioliquor/glucosiosiero x 100; valore di
riferimento, > 45%)
La determinazione dell’albumina nel siero e nel liquor è l’indice più accurato del
grado di permeabilità della barriera emato-liquorale (danno di barriera) e deve
sostituire il solo dosaggio delle proteine totali liquorali.
Il danno di barriera è esprimibile sia come rapporto tra albumina nel siero e albumina
nel liquor (Albsiero/Albliquor, valore di riferimento, > 130) o come quoziente
albumina (Albliquor/Albsiero) x 1000 (valore di riferimento, < 7.0), oppure x 100
(valore di riferimento, < 0.7)
La determinazione delle proteine totali liquorali andrebbe ristretta ai casi nei quali
l’esame biochimico deve essere effettuato in urgenza (sospetto di
meningite/meningoencefalite), se non sia possibile determinare l’albumina.
Quoziente Albumina
ETA’(anni)
Valori Normali Q
103
< 15
< 5.0
15 –30
< 5.5
31 – 39
< 6.5
40 – 60
< 8.0
> 61
< 9.0
(alb)
x
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
Esame biochimico
L’espressione quantitativa della sintesi intratecale di IgG si ottiene utilizzando funzioni nonlineari, come le formule di Reiber, oppure, numericamente
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
Esame biochimico
L’espressione quantitativa della sintesi intratecale di IgG si ottiene utilizzando funzioni nonlineari, come le formule di Reiber, oppure, numericamente
Esame del liquido cerebrospinale
http://www.aini.it/files/pdf/50158.pdf
Esame biochimico
La determinazione liquorale del lattato è utile nel sospetto di
meningite/meningoencefalite settica
La concentrazione del lattato liquorale è indipendente da quella sierica.
La determinazione liquorale di IgA e IgM può essere utile nella diagnosi di
neurotubercolosi (IgA) e di neuroborreliosi (IgM), sebbene tali patologie
possano essere diagnosticate con test più specifici.
La determinazione di anticorpi antigene-specifici nel siero e nel liquor nelle
meningoencefaliti virali o in altre patologie infettive del sistema nervoso
centrale si effettua valutandone il razionale
Altri esami di più stretta pertinenza neurologica (ad esempio:
proteina , proteina  iperfosforilata, proteina 14.3.3, amiloide 1-42, NSE,
asialo-transferrina), necessitano di standardizzazione nel prossimo futuro.
Sensibilità
cut-off
Le determinazioni quantitative
Specificità
Glicorrachia
91%
96%
< 40%
Lattato
94%
95%
> 4.2
(% trasferimento
siero/liquor)
(rimane elevato anche
dopo terapia antibiotica)
mM/L
Nel differenziare meningiti settiche dalle asettiche
Sierologia liquorale
• il quoziente anticorpale totale
QIgtot = L Ig / S Ig
quantità di immunoglobuline liquorali rispetto alle sieriche
• quoziente anticorpale specifico
QIgspec = L AbSpec / S AbSpec
quantità di anticorpi liquorali specifici rispetto ai sierici
• L’indice anticorpale specifico
IAspec = Q Igspec / Q Igtot
(v.n. = 0,5 - 1,5)
attività anticorpale specifica liquorale rispetto alla sierica
Parametri liquorali nella sclerosi
multipla
Nel 1971 Hans Link evidenziò che, nella
maggior parte dei casi di pazienti affetti da
sclerosi multipla, la zona gamma del tracciato
elettroforetico liquorale presentava numerose
bande, assenti nel tracciato sierico dello
stesso paziente
Le linee-guida riguardanti l’analisi del
liquido cerebrospinale
L’analisi del liquido cerebrospinale ruota attorno alla
diagnosi di sclerosi multipla, malattia che entra in diagnosi
differenziale con la maggior parte delle altre malattie
neurologiche che richiedono la puntura lombare
Bibliografia di riferimento
Andersson M, Alvarez-Cermeño J, Bernardi G, et al. Cerebrospinal
fluid in the diagnosis of multiple sclerosis: a consensus report. J
Neurol Neurosurg Psychiatry 1994;57:897-902
Reiber H. External quality assessment in clinical neurochemistry:
survey of analysis for cerebrospinal fluid (CSF) proteins based on
CSF/serum quotients. Clin Chem 1995;41:256-63
Watson MA, Scott MG. Clinical utility of biochemical analysis
of cerebrospinal fluid. Clin Chem 1995;41:343-60
Le bande oligoclonali liquorali sono presenti sia nella
sclerosi multipla sia nelle encefaliti infettive
Qual è il valore predittivo positivo per sclerosi multipla delle bande oligoclonali?
Laboratorio di
profilo
neurologico
Laboratorio di
profilo
infettivologico
Valore predittivo per
sclerosi multipla elevato
Valore predittivo per
sclerosi multipla quasi nullo
Restringere il campo delle possibilità diagnostiche e
collocare il paziente in una popolazione nella quale la
malattia sospettata è “sufficientemente prevalente”
Le determinazioni qualitative
Le bande oligoclonali liquorali sono formate da
immunoglobuline, generalmente IgG, che
migrano nella regione  in elettroforesi o nella
regione catodica in isoelettrofocusing
Identificano la sintesi immunoglobulinica
intratecale con maggiore sensibilità rispetto
agli indici calcolati (Link e Reiber): informazione
essenziale per confermare o escludere un’attivazione
immunitaria all’interno del SNC
La tecnica separativa raccomandata per la
determinazione delle bande oligoclonali IgG è
l’ isoelettrofocusing (Consensus europeo, 1994)
The Principle of Isoelectric Focusing. A pH gradient is established in
a gel before loading the sample. (A) The sample is loaded and voltage
is applied. The proteins will migrate to their isoelectric pH, the location
at which they have no net charge. (B) The proteins form bands that can
be excised and used for further experimentation.
Le determinazioni qualitative
Metodica di riferimento
• Isoelettrofocusing siero e liquor in gel di agarosio
• Passive transfer delle proteine su nitrocellulosa
• Immunodetezione per IgG
Consensus europeo (1994)
Affiancare silver staining
all’immunodetezione per IgG
Colorare bande non-IgG
(catene kappa e lambda,
IgA, frammenti di IgM)
La procedura non è cost-effective
Le determinazioni qualitative
Campioni
• Pareggiare siero e liquor per il contenuto di IgG
seminare campioni appaiati di siero e liquor
• Non è ammessa la concentrazione del liquor
bandite le colorazioni poco sensibili, come il Blue
Coomassie
Interpretazione: le bande oligoclonali (OCB) nel siero
(S) e nel liquor (LCS) si combinano in cinque pattern
S
tipo 1
tipo 2
tipo 3
tipo 4
tipo 5
LCS
Distribuzione policlonale delle IgG, assenza di
sintesi intratecale
OCB solo liquorali, presenza di sintesi intratecale
(processi immuno-infiammatori cronici del SNC)
OCB solo liquorali + OCB S=LCS, presenza di sintesi
intratecale (processi immuno-infiammatori acuti del SNC)
OCB S=LCS (mirror pattern), assenza di sintesi
intratecale (processi immuno-infiammatori sistemici)
OCB S=LCS, spaziat. regolare e intensità decresc.
assenza di sintesi intratecale (gammapatie monocl.)
(Consensus europeo, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994;57:897-902)
pH
6.0
9.5
6.0
9.5
6.0
9.5
6.0
9.5
6.0
9.5
Panencefalite
sclerosante subacuta
Sclerosi multipla
totalità
M. infettive del SNC
molto frequenti *
Neurosarcoidosi
frequenti
Collagenopatie con
interessamento SNC
Encefalomieliti postinfettive/vacciniche
Sd. di Guillain-Barrè
abbastanza
frequenti
poco frequenti
M. cerebro-vascolari
poco frequenti
M. degenerative SNC
rare
Tumori del SNC
rare
Malattie da prioni
assenti
Altre m. neurologiche
occasionali
Popolazione generale
occasionali
quasi totalità
Le bande
oligoclonali nelle
malattie
neurologiche
Dati non univoci
in letteratura
poco frequenti
Studi collaborativi: mettere
insieme dati liquorali in
numero idoneo
* dipende dal momento in cui si
effettua la puntura lombare in
rapporto alla fase di malattia e
dalla natura dell’agente patogeno
Scarica

nel siero