LA DIAGNOSI DEI
LINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Dott.ssa Cristina Colarossi
Anatomia Patologica
Istituto Oncologico del Mediterraneo
Catania
Linfomi
•I
Linfomi sono malattie monoclonali neoplastiche
caratterizzate dalla proliferazione di linfociti B o T negli
organi linfoidi.
• Causano un sovvertimento strutturale del linfonodo
• Nella maggioranza dei casi la diagnosi si basa su aspetti
morfologici ed immunofenotipici
• Nel 5-15% dei casi sono necessarie analisi molecolari per
conferma diagnostica
ANATOMIA DEGLI ORGANI LINFOIDI
Classificazione dei linfomi
A CELLULE B
• Immature
• Mature
• CLL/SLL
• Folliculare
• Marginale
• Diffuso a grandi cellule
• Mantellare
• Burkitt
• Mieloma plasmacellulare
•
•
•
•
•
•
•
A CELLULE T/NK
Immature
Mature
NOS
Angioimmunoblastico
Micosi fungoide/Sézary
Anaplastico a grandi
cellule
• LINFOMA DI HODGKIN
Clonalità dei linfomi
• L’analisi della clonalità delle cellule linfoidi attraverso
l’amplificazione, mediante PCR, delle regioni VDJ dei geni
delle immunoglobuline (IG) e del recettore dei linfociti T
(TCR) permette di distinguere processi reattivi (policlonali)
dalle neoplasie (monoclonali)
LOCI DELLE IMMUNOGLOBULINE
•
•
•
•
I segmenti genici V (Variable) sono collocati
all'estremità 5' di ciascun locus delle Ig. Sono lunghi
mediamente 300 bp.
I segmenti genici D (Diversity) sono collocati oltre i
segmenti V e sono presenti solo nel locus per le catene
pesanti delle Ig
I segmenti genici J (Joining) sono collocati a valle dei
segmenti D. Ciascun segmento J è lungo 30-50 bp.
I segmenti genici C (Constant) codificano per la
regione costante delle catene pesanti e delle catene
leggere Ig
Loci delle catene delle immunoglobuline
TCR
• I loci codificanti per le quattro catene del TCR (α, β, γ, δ)
sono collocati
• sul cromosoma 7
• sul cromosoma 14
• Nei loci per i geni del TCR la struttura è simile a quella dei
loci genici per le Ig, si riscontrano ancora una volta
segmenti V, D, J e C.
• Le catene α e γ non possiedono segmenti D
Loci del TCR
Riarrangiamenti genici
• I geni delle immunoglobuline e del TCR contengono molti
segmenti VDJ che vengono riarrangiati durante lo
sviluppo iniziale dei linfociti
• Il processo di riarrangiamento affianca casualente un
segmento V, uno D, ed uno J in modo da creare le regioni
variabili di geni ricombinati che possono essere trascritti
in mRNA e codificare per i recettori dell’antigene.
Fasi del Riarrangiamento
• I riarrangiamenti sono mediati da un complesso
enzimatico nel quale le proteine RAG1 e RAG2
agiscono tagliando a livello di speciali sequenze
segnale (regioni RSS)
• Dopo il taglio inserzioni o delezioni di nucleotidi
aumentano la diversificazione
• L’ultima tappa è l’avvicinamento dei segmenti
genici
Clonalità dei linfomi
• Clonalità linfomi B
• Clonalità linfomi T
• Valutazione molecolare del
• Valutazione molecolare del
riarrangiamento del gene
IgH:(catena pesante delle
immunoglobuline)
riarrangiamento del gene
gamma del recettore dei
linfociti T (TCR gamma)
• Valutazione molecolare del
• Valutazione molecolare del
riarrangiamento del gene
IgK: (catena leggera delle
immunoglobuline)
riarrangiamento del gene
beta del recettore delle
cellule T (TCR beta).
BIOMED 2
• Uno studio coordinato dal gruppo BIOMED 2 (ora
chiamato euroclonality consortium) ha standardizzato i
protocolli con multipli set di primers (Van Dongen,
Leukemia, 2003)
• Numerosi lavori scientifici nel decennio successivo hanno
confermato la sensibilità, specificità e riproducibilità dei
test
• Tali protocolli possono essere applicati allo studio di
campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina,
agoaspirati e biopsie osteomidollari decalcificate
Limiti degli studi molecolari
• Sensibilità limitata in caso di un normale background
policlonale, (es Linfoma B T cell rich) con percentuale di
linfociti clonali < 10%
• Clonale non è sempre sinonimo di malignità (processi
linfoproliferativi EBV correlati o proliferazioni cutanee
benigne a fenotipo T)
• I riarrangiamenti di Ig e TCR non sono esclusivi di
una linea cellulare: riarrangiamenti di TCR possono
riscontrarsi in neoplasie immature a fenotipo B o alcune
leucemie mieloidi acute.
Valutazione qualità del DNA
• Il DNA estratto da tessuti FFPE è di qualità subottimale e
potrebbe contenere inibitori della PCR
• E’ essenziale valutare l’integrità e l’amplificabilità del DNA
• Il protocollo BIOMED 2 ha standardizzato una multiplex
PCR contenente i primers di geni housekeeping di 100,
200, 300 e 600 paia di basi
• Per l’analisi di IGH/TCR la PCR di controllo dovrebbe
amplificare prodotti di almeno 300 bp
Analisi qualitativa DNA
AF4
PLZF
RAG1
TBXAS
La presenza delle 4 bande indica che il DNA genomico
è integro. La qualità del campione è idonea per
effettuare amplificazioni, mediante PCR, anche di
frammenti di grosse dimensioni
Clonalità IGH
• Tre set di primers amplificano 3 regioni nella regione
•
•
•
•
variabile e la regione J
Due set di primers amplificano la regione D e J
L’analisi dei prodotti di PCR può essere condotta con
metodica:
Heteroduplex: i prodotti di PCR vengono denaturati a
95°, rinaturati a 4°e poi corsi su gel di poliacrilamide al 6%
Gene scanning: i primers devono essere marcati con
fluorocromo per analizzare i prodotti di PCR con metodi
automatizzati (es sequenziatore 3500)
Clonalità IGH
Analisi dei prodotti di PCR
Analisi riarrangiamento del gene IGH
Ipermutazione somatica (Maturazione
dell’affinità
• Negli organi linfoidi periferici i linfociti B maturi
(centrociti o cellule del centro germinale)
subiscono un’ulteriore diversificazione nel sito di
riconoscimento antigenico tramite il processo di
ipermutazione somatica.
• Dopo l’incontro con l’antigene e la stimolazione del
linfocita B da parte di un linfocita T helper, si
generano delle mutazioni puntiformi nelle regioni
geniche codificanti per i domini variabili di IGH.
Leucemia Linfatica Cronica
• In circa il 50% dei casi la cellula neoplastica origina in una
fase di maturazione linfocitaria antigene indipendente
(pre-centro germinativo nel linfonodo).
Non sono
presenti mutazioni somatiche del gene IgVH
• Nel restante 50% dei casi circa la cellula neoplastica
origina in fase maturativa Ag dipendente, post centro
germinativo. Sono presenti mutazioni somatiche del
gene IgVH
Stato mutazionale di IGVH nella LLC
• M-CLL (mutata): a buona prognosi;
• U-CLL (non mutata) a prognosi infausta
• Cut-off: 98% di identità con la sequenza germline
• Linee guida per l’analisi molecolare (European
Research Initiative on CLL, ERIC
reccomendation)
• Lo stato mutazionale puo’essere determinato in
qualsiasi momento.
IGH Hypermutation
Traslocazioni e riarrangiamenti nei linfomi
Riarrangiamenti
B-cell Linfoma/Leuk
T-cell Linfoma/Leuk
Patologia
Catene pesanti Ig
T-cell receptor
Traslocazione
Linfoma follicolare t(14;18)
Linfoma mantellare t(11;14)
Linfoma di Burkitt t(8;14)
Linfoma anaplastico t(2;5)
Geni coinvolti
BCL2-IgH
BCL1-IgH
MYC-IgH
ALK-NPM
BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21)
• Presente nel 90% dei FL e nel 20% dei DLBCL
• Giustappone il gene che codifica per l’elemento J delle
catene pesanti delle immunoglobuline, (14q32), al gene
Bcl-2 (18q21)
• Pone BCL2
sotto il diretto controllo trascrizionale di
enhancers del locus IGH e successiva alterazione
dell’espressione della proteina
• La valutazione della traslocazione è di ausilio diagnostico
per distinguere il linfoma da iperplasia linfoide benigna
• Monitorare la recidiva neoplastica e la malattia minima
residua.
BCL2/JH
• Maior Breakpoint Region (MBR): 70% delle rotture del
gene bcl2 al livello del terzo esone
• Minor cluster region (mcr) :I rimanenti punti di rottura
sono situati 20 kb a valle del terzo esone.
• Analisi cariotipica
• FISH
• Southern blotting
• PCR
Traslocazione t(14;18) BCl2/JH
CT (-): --- bp
Dimensione ampliconi di controllo
CT (+): 250 bp
FOLLOW UP
La malattia minima residua
• La presenza di un basso numero di cellule
neoplastiche dopo terapia viene definito come
malattia minima residua (MRD)
• Metodiche di RT PCR consentono di evidenziare
la presenza di numerose traslocazioni con
maggiore precisione e sensibilità (1x105) rispetto
alla citogenetica convenzionale (1x102)
• RT-PCR è pertanto
il metodo di scelta per
monitorare la risposta al trattamento e
l’eradicazione completa di cellule neoplastiche
durante il corso della malattia
NEXT GENERATION SEQUENCING
NGS
NGS
• Le due tipologie di piattaforme NGS più diffuse
permettono il sequenziamento parallelo massivo
di molecole di DNA amplificate in modo clonale.
• Nelle tecnologie NGS, il sequenziamento viene
effettuato mediante cicli ripetuti di estensioni
nucleotidiche ad opera di una DNA-polimerasi.
• La procedura è parallela e massiva, e consente
di sequenziare da centinaia di Mb fino a Gb di
DNA in un’unica seduta analitica.