Caso Clinico
Emoglobinuria parossistica notturna
Francesca Tosato
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica
Università degli Studi di Padova - Azienda Ospedaliera di Padova
Paziente
Maschio, 16 anni
 Clinica
di Oncoematologia Pediatrica (Azienda
Ospedaliera di Padova)
 Richiesta Sottopopolazioni linfocitarie
 Notizie cliniche: paziente affetto da
SINDROME MIELODISPLASTICA (CITOPENIA
REFRATTARIA)

Raccordo anamnestico (APP)

Marzo 2010: Ospedale di Kiev (Center of Pediatric
Oncology/Hematology and BMT of National
Children’s Hospital “OCHMATDYT”) diagnosi di
SINDROME MIELODISPLASTICA, VARIANTE
IPOCELLULARE
PEC: anemia e piastrinopenia
 Aspirato
midollare: ipocellularità, 0,5% blasti,
dismielopoiesi trilineare, non anomalie citogenetiche
Trattamento secondo protocollo per anemia aplastica
(ATG + metilprednisolone + CSA, poi solo CSA fino
al 02.04.11)

Raccordo Anamnestico (APP)
Ultimo ASPIRATO MIDOLLARE eseguito in
Ucraina 16.11.10  Ipercellularità con aumento della
componente eritropoietica senza alterazioni di
maturazione né dismielopoiesi; granulociti per lo più
immaturi con dismielopoiesi (ipogranulazioni);
macrofagi con segni di emofagocitosi e presenza di
plasmacellule.
RICERCA DONATORE DI MIDOLLO NON
CORRELATO
Raccordo Anamnestico (APP)

Aprile 2011: il pz è inviato presso la Clinica di
Oncoematologia Pediatrica (Azienda Ospedaliera
di Padova) per effettuare trapianto di cellule
staminali emopoietiche midollari da donatore
volontario

Aspirato midollare + BOM:
CITOPENIA REFRATTARIA
(FISH e citogenetica negative)




Granulociti immaturi
Granulociti eosinofili
Mielodisplasia
Emoglobinuria parossistica notturna
Esami Ematochimici
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
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
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


Amilasi Pancreatica 15 U/L (0-53)
Lipasi 19 U/L (0-60)
AST, ALT, gGT, IgG, IgA, IgM, IgD nella norma
Bilirubina Coniugata 4,2 umol/L (fino a 3,4)
Ferro 16,7 umol/L (11,6-31,3)
Ferritina 492 ug/L (31-300)
LAD 1908 U/L (0-680)
PCR 145,00 mg/L (0,00-6,00)
ETF: stato infiammatorio
Componente C3 1,87 g/L (0,90-1,80)
Componente C4 0,41 g/L (0,09-0,36)
C3 Attivatore 508 mg/L (200-450)
Esame Urine (sedimento): Eritrociti 27 el/uL
Emoglobinuria parossistica
notturna (EPN/PNH)






Patologia rara (1,3/1x106 casi per anno)
Colpisce in tutte le aree del mondo
prevalentemente nel sud est asiatico
Colpisce a tutte le età
Non è congenita, non è ereditata
Non è documentata familiarità
È un disordine ematologico acquisito
PATOGENESI
Cellula staminale emopoietica è una cellula
capace di riprodurre se stessa e,
contemporaneamente, produrre cellule figlie
che, attraverso successivi processi di
differenziazione e maturazione,
daranno origine agli elementi maturi.
CROMOSOMA X
gene PIG A (Xp 22.1)
GPI
Enzima necessario per la sintesi di
glicosilfosfatidilinositolo (GPI)
GPI: serve da sistema di
ancoraggio per numerose
proteine
presenti
normalmente sulla superficie
della membrana plasmatica
(GPI anchor – proteins)
CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA
PROGENITORE MIELOIDE COMUNE
PROGENITORE LINFOIDE COMUNE
Le cellule staminali colpite e la loro progenie esprimono difetti totali o parziali delle proteine
ancorate alla membrana mediante GPI (GPI anchor PROTEINS)
Clone: condizione necessaria ma
non sufficiente
Danno autoimmune
Proteins Deficient on PNH Blood Cells
CD55
CD58
CD59
PrPC
AChE
JMH Ag
Dombroch
HG Ag
CD55
CD58
CD59
CD109
PrPC
GP500
Gova/b
B cells
RBC
Haematopoietic
Stem Cell
T cells
Platelets
CD55CD58
CD59CD14
CD16CD24
CD48CD66b
CD66c
CD87
CD109
CD157
LAPNB1 PrPC
p50-80
GPI-80
ADP-RT
NA1/NA2
CD59, CD90, CD109
Monocytes
PMN
CD14
CD59
CD87
CD55
CD48
CD109
CD157
Group 8 PrPC
80
CD16
CD58
CD52
GPI-
CD55
CD58
CD59
CD48
CD52
PrPc
CD16
CD24 CD55
CD58 CD59
CD48 PrPC
CD73
CD1081
CD55 CD58
CD59 CD48
CD52 CD87
CD108
PrPc
ADP-RT CD73
CD90 CD109
CD16
NK cells
CD59/MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis)
La distruzione dei RBC si manifesta come un'emolisi intravascolare
e provoca il rilascio nel plasma del contenuto cellulare
Esami di laboratorio
Anemia
(diminuzione
dell'emoglobina con valori che
possono scendere anche sotto a
8gr/dl)
Aumento del numero dei
reticolociti che rivela la
normale risposta del midollo alla
diminuzione periferica di RBC; il
conteggio dei reticolociti, nel
caso di severa anemia emolitica,
può risultare aumentato fino al
20%
Incremento della bilirubina
indiretta (non coniugata) per
conversione
liberata
dell'emoglobina
Aumento della lattatodeidrogenasi
(LDH)
liberata dai RBC lisati
Diminuzione dei livelli di
aptoglobina libera in quanto
l'emoglobina si lega all'aptoglobina
e
il
complesso
emoglobinaaptoglobina viene rapidamente
rimosso dal circolo ad opera degli
epatociti
Emoglobinuria
alle urine il
rosso-bruno
che conferisce
caratteristico colore
Carenza di ferro conseguente alla perdita
marziale attraverso le urine
Manifestazioni cliniche
stanchezza,
affanno,
pallore,
palpitazioni
tendenza a trombosi dovuta a:


1.
2.
3.
rilascio all’interno del circolo ematico
di sostanze procoagulanti da parte dei
globuli rossi lisati
attività procoagulante dell’emoglobina
libera
incrementata attivazione delle piastrine
complemento-mediata
dolore addominale, disfagia, spasmo
esofageo, ipertensione polmonare
dovuti a:

1.
legame dell'emoglobina libera con NO
con conseguente contrazione della
muscolatura liscia
Anamnesi fisiologica e
patologica remota






Non problemi nel gentilizio
Crescita regolare
Salmonellosi a 4 mesi
Pancreatite a 3 anni
Frequentissimi episodi di dolore addominale
Non emissione di urine scure
Altri accertamenti



Elastasi fecale: negativa (>500 ug/g di feci)
Breath test: negativo
28.09.11 EGDS in pz con sdr mielodisplastica ed
epigastralgia:
1.
2.
3.
4.
esofago, cardias e stomaco regolari;
bulbo con 2 erosioni puntiformi biancastre;
Istologia: Campione di mucosa della II porzione duodenale
con regolare rapporto villo/cripta (v.n.=3/1) e con infiltrato
linfocitario intraepiteliale CD3+ pari a 15/100 enterociti
(v.n.<25/100). Campioni
di mucosa gastrica antrale
iuxtapilorica (piccola curva) nei limiti di norma. Campione di
mucosa esofagea (giunzione esofago-cardiale linea Z) con
iperplasia del compartimento proliferativo dell’epitelio
pavimentoso.
HP negativo
Esami Ematochimici













Amilasi Pancreatica 15 U/L (0-53)
Lipasi 19 U/L (0-60)
AST, ALT, gGT, IgG, IgA, IgM, IgD nella norma
Bilirubina Coniugata 4,2 umol/L (fino a 3,4)
Ferro 16,7 umol/L (11,6-31,3)
Ferritina 492 ug/L (31-300)
LAD 1908 U/L (0-680)
PCR 145,00 mg/L (0,00-6,00)
ETF: stato infiammatorio
Componente C3 1,87 g/L (0,90-1,80)
Componente C4 0,41 g/L (0,09-0,36)
C3 Attivatore 508 mg/L (200-450)
Esame Urine (sedimento): Eritrociti 27 el/uL
Pazienti da testare




Anemia emolitica Coombs-negativa
Emoglobinuria macroscopica o
biochimicamente rilevabile
Propensione a fenomeni tromboembolici
venosi in sedi atipiche (vene mesenteriche,
vena porta, vena epatica, vene cerebrali)
Citopenie di grado variabile (pancitopenie,
anemie aplastiche, mielodisplasie con
citogenetica negativa)
Classificazione della PNH
Nel 2005 l'INTERNATIONAL PNH INTEREST GROUP ha
proposto uno schema classificativo della PNH
TIPO
EMOLISI
STATO del BM
DIMENSIONE DEL
CLONE
PNH
CLASSICA
FLORIDA/EMOGLOBIN
URIA MACROSCOPICA
BM iper o normo
cellulato
>50%
Alterazioni assenti
PNH nel
LIEVE-MODERATA/
contesto di AA EMOGLOBINURIA
INTERMITTENTE
PNH
SUBCLINICA
nel contesto di
AA
INSUFF
MIDOLLARE
ASSENZA DI EMOLISI E INSUFF
DI EMOGLOBINURIA
MIDOLLARE
<30%
<1%
Test diagnostici



1.
2.
3.
4.
5.
6.
SAGGI BIOCHIMICI (test di HAM)
BIOLOGIA MOLECOLARE (sequenziamento del gene
PIG A)
CITOFLUORIMETRIA
Metodica GOLD STANDARD per la diagnosi
Rapida
Permette
di
studiare
piu'
linee
cellulari
contemporaneamente
Permette di studiare piu' proteine contemporaneamente
Quantitativa
Discrimina cellule con totale o parziale deficit di gpianchor proteins
Fase preanalitica
Informazioni rilevanti sul paziente:




Ha ricevuto trasfusioni?
Ha avuto episodi emolitici recenti?
Valori dell'emocromo
Eventuali terapie in corso
Caratteristiche del campione:



Prelievo di sangue periferico in eparina o EDTA
(NON
DEVE
MIDOLLARE)
ESSERE
UTILIZZATO
SANGUE
Il test va eseguito entro le 24h, comunque non oltre le 48h
Fase analitica
Quali linee cellulari vanno studiate?



Granulociti (per l'individuazione e la corretta
quantificazione del clone)
RBC (per l'individuazione del clone ma
possono sottostimarne la dimensione per i
fenomeni di emolisi e/o trasfusione)
Monociti (a conferma della presenza del clone)
Classification of PNH cells


cell count

PNH I
PNH II
PNH III
Normal cells
Partial deficiency
Complete deficiency
III
II
I
fluorescence intensity
Pannelli utilizzati in house
Linea
cellulare
FL1
FL2
FL3
FL4
FL5
Strategia di gating
Granulociti/
CD66b
CD14
CD45
CD33
CD16
CD45/SSC
(granulociti)
monociti
CD33/SSC (monociti)
RBC
CD59
Linea
cellulare
FL1
FL2
FL3
Granulociti/
FLAER
CD33
CD45
FSC/SSC
CD45
monociti
FL4
FL5
Strategia di gating
CD14
CD45/SSC
(granulociti)
CD33/SSC (monociti)
RBC
CD59
CD45
FSC/SSC
FLAER (fluorescent Aerolysin)



Tossina batterica inattivata
capace di legarsi all'ancora di
GPI
quindi
capace
di
identificare la presenza o
l'assenza di tutte le molecole
GPI-linked
Non utilizzabile sui RBC
perchè sprovvisti dell'enzima
indispensabile per atttivare la
funzione di legame di FLAER
Reagente di riferimento per la
ricerca
del
clone
su
granulociti/monociti.
WBC
Strategia di gating: FSC/SSC
CD45/SSC per i granulociti
CD33/SSC per i monociti
WBC
CONTROLLO
CLONE PNH
GRANULOCITI
CELLULE NORMAL
PAZIENTE
CD16
WBC
CONTROLLO
CLONE PNH
MONOCITI
CELLULE NORMALI
PAZIENTE
CD14
CONTROLLO
RBC
PAZIENTE
Amplificazione log per FSC/SSC
Strategia di gating: FSC/SSC
Valutazione di CD59
RBC
La differenza di dimensioni del clone
tra RBC e WBC è da attribuirsi ad
emolisi e/o a trasfusioni
MONOCITI
Cytometry B Clin Cytom. 2012 Apr 26
GRANULOCITI
A simple flow cytometric assay for routine paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
testing based on immature reticulocytes and granulocytes
Tsagarakis NJ, Paterakis G.
FLAER su CONTROLLO
FLAER su PAZIENTE
WBC
GRANULOCITI
MONOCITI
CONTROLLO
RBC
PAZIENTE
Diagnosi
PNH (emoglobinuria parossisitica notturna) con
mielodisplasia (citopenia refrattaria con
displasia trilineare secondo WHO)
Ricovero presso Oncoematologia
Pediatrica per TCSE
(14.11.11 - 21.02.12)
RIVALUTAZIONE POST TRAPIANTO
15/12/2011
17/09/2012
GRANULOCITI
MONOCITI
RBC