Università degli Studi di Torino
Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche
Immunologia Molecolare
Emoglobinuria
Parossistica Notturna
22 novembre 2007
Genuardi Elisa
L’Emoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una rara patologia
acquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di
una o più cellule staminali ematopoietiche, causata da mutazioni
somatiche a livello del gene PIGA sul cromosoma Xp22
[2]
…Un po’ di Storia…
1866: Sir William Gull descrisse il caso di un giovane paziente con
“ematinuria”
1882: Strubin, riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi
descritti
1928: Enneking conia il nome di Emoglobinuria Parossistica Notturna
1930: Ham osserva che i globuli rossi nella PNH sono sensibili alla lisi
mediata dal complemento
1956: deficit di AChE negli eritrociti di pz con PNH
1970-1990: identificazione delle proteine transmenbrana mancanti nei
globuli rossi si pz con PNH con un ruolo nella lisi complemento-mediata
1993: Kinoshita isola il gene PIG A come responsabile delle
caratteristiche molecolari dell’EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA
NOTTURNA
…PIG A e biosintesi delle GPI
anchor proteins…
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
PIG A
[5]
…le Conseguenze….
[5]
…CD 55 e CD 59…
CD59
CD55
http://asheducationbook.hematologylibrary.org
Azione su C3-C5 convertasi
[6]
inibisce MAC
Azione su C3-C5 convertasi
inibisce MAC
piastrine
Deficit u-PAR
INIBIZIONE ATTIVITA’
FIBRINOLITICA e
INDOTTA
ESPRESSIONE
ATTIVITA’
PROTROMBINICA
Microvescicolazione complessi MAC e
lisi cellule
…Caratteristiche Cliniche…
•Emoglobinuria
•Trombosi
•Anemia
•Disfagia
•Dolori addominali
•Spasmi esofagei
•Impotenza maschile
http://www.thecrookstoncollection.com
http://www.hmds.org.uk
…Diagnosi…
TEST DI HAM studia la sensibilità delle emazie al complemento in
mezzo acido a ph 6.5 e a 37°C
TEST AL SACCAROSIO studia l’anomala sensibilità al complemento
delle emazie in un mezzo a debole forza ionica
LIMITI
Non sensibile
No quantificativo
Falsi negativi
Adattata da Pasquinelli F.”Diagnostiche e Tecniche di Laboratorio”
CITOFLUORIMETRIA
•Permette la quantificazione
•Tecnica sensibile (minimo 0,003% cells GPI -AP-)
•Utilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD55
e anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellulari
[8]
FLAER
(Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin)
[6]
•Alta affinità e specificità per “l’ancora” delle GPI-APs
•Identifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosi
•La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi
orofagei e disfunzioni erettili.
[2]
…MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO…
…MOISACISMO CELLULARE SOMATICO…
Osservato con test di sensibilità alla lisi complemento-mediata e
confermato con esperimenti di citofluorimetria e FLAER
Pazienti con PNH possono presentare 3 popolazioni di GR:
PNH I  normali, GPI-APs presenti
PNH II  deficit parziale di GPI-APs
PNH III  deficit totale
La gravità della patologia è molto influenzata dalla percentuale di cellule
appartenenti alle 3 popolazioni!!
[1]
???MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO????
Gene PIG A(6 esoni)
Esone 1 molto corto, non è tradotto
Esone 2 codifica per gran parte del trascritto
[1]
Xp22
Proteina di 54 kD, 484 aa con una sequenza
idrofobica di 27 aa nei pressi del C- terminale
Modelli in vivo:
KO Pig A  letale a livello embrionale
KO condizionali emolisi intravascolare (conferma aspetti clinici)
[9]
Donne e uomini: stessa frequenza di PNH
HSC
HSC
XX
XY
Inattivazione X
Mutazioni somatiche su PIG A
PNH
… Le Mutazioni …
1995 Bessler et al analizzano
il cDNA di PIG A in quattro linee
cellulari GPI-AP-
INSERZIONI E DELEZIONI:
•Mutazioni missense
(cambio aa)
•Mutazioni nonsense (stop
codon prematuro)
•Mutazioni su siti di
splicing (lunghezza mRNA
e stabilità)
[10]
La perdita del trascritto funzionante è
dovuta a exon skipping dell’esone 2
DELEZIONE regione
promoter (CAAT motifs),
esone 1 e parte dell’introne
1 determina una diminuita
ma non assente
espressione delle GPI-APs
2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di PIG A
anche in cellule di sani
Policlonali
Avvengono su cellule che non
si autorinnovano
[11]
Molti studi clinici individuano in pazienti con patologie ematologiche
una percentuale di cellule GPI-APs -
ANEMIA APLASTICA
PNH
MIELODISPLASIE
P.S: anche i sani hanno mutazioni somatiche in PIG A
Riconosciuto come non
self REAZIONE
AUTOIMMUNITARIA
HSC
Antigene self
??? GPI-AP???
ESCAPE ALLA REAZIONE
IMMUNITARIA
PIG A mut
HSC
Ma
Deficit di GPI-APs EMOLISI e
PNH!!!!
… DUE REQUISITI…
•Presenza di mutazioni a livello di PIG A
•Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule
GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla
crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria)
•Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A
sono CLONALI ( colpiscono la stessa regione del gene)
Il clone che trae
maggior vantaggio alla
crescita dal
microambiente
“autoimmune”,
prolifera senza limiti
per ripristinare una
normale emopoiesi
Telomere Restriction Fragments
di pz con PNH è molto più corto
rispetto ai sani evidenza di
una spiccata proliferazione
A livello periferico si riflette la
mancanza delle GPI-APs
IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!
La PNH è una rara patologia acquisita caratterizzata da
un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali
ematopoietiche
Classical PNH
PNH associata a bone marrow failure
Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi)
… un po’ di dati…
•Sono affetti da PNH 8000-10000 persone nel Nord America e Europa
Occidentale
•Età di insorgenza: 30-40 anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno)
•50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa
occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali)
•Sopravvivenza stimata 10 anni
•Terapia mirata ad ogni singola caratteristica clinica
…TERAPIA…
CORTICOSTEROIDI emolisi cronica
ANDROGENI in possibile combinazione con STEROIDIinibizione
del complemento
SOMMINISTRAZIONE FERRO e FOLATI/TRASFUSIONI  anemia
(attenzione alle patologie da sovraccarico di ferro e incompatibilità
sistema ABO)
WARFARINA trombosi
Ma il futuro è….
ECULIZUMAB
(against complement C5)
…References…
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