Elisa Cannizzo - Luigi Del Vecchio - Massimo Geuna
Raccomandazioni per la caratterizzazione
citometrica dell’Emoglobinuria
Parossistica Notturna
Elisa Cannizzo
Dip. di Oncologia, dei Trapianti e delle Nuove Tecnologie in Medicina, Università di Pisa
Unità Operativa analisi chimico cliniche, Ospedale Campo di Marte, ASL 2 Lucca
Luigi Del Vecchio
Istituto CEINGE - Biotecnologie Avanzate, Napoli
Massimo Geuna
Dip. di Patologia, Lab. di Immunopatologia, Ospedale Mauriziano Umberto I, Torino
(I tre Autori costituiscono il “Gruppo di Studio CLONEPnh” per la compilazione di queste raccomandazioni)
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Prima edizione: gennaio 2012
Premessa
Nonostante la citometria a flusso sia considerato il metodo standard per l’identificazione dei deficit di proteine GPIlinked, ad oggi non esistono raccomandazioni metodologiche prodotte da gruppi di studio italiani.
In questo documento presentiamo un lavoro di ricerca di consenso tra specialisti italiani coinvolti nei processi diagnostici
dell’Emoglobinuria Parossistica Notturna (EPN, in inglese PNH), che rappresenta un tentativo di individuare le tappe
critiche ed i principali passaggi necessari per identificare un Clone PNH.
Sommario
Principi generali......................................................................................................... 3
Emoglobinuria Parossisitica Notturna e Clone PNH.............................................................................................................. 3
La PNH e l’ancora GPI............................................................................................................................................................... 3
Caratterizzazione della PNH..................................................................................................................................................... 3
In quali pazienti eseguire il test citometrico............................................................................................................................. 5
A che cosa serve il test citometrico........................................................................................................................................... 5
Descrizione del metodo.............................................................................................. 7
Fase preanalitica.............................................................................................................................................................................. 7
Fase analitica..................................................................................................................................................................................... 7
Quali cellule................................................................................................................................................................................. 7
Quale sensibilità.......................................................................................................................................................................... 7
Passaggi operativi per caratterizzare i granulociti neutrofili................................................................................................... 10
Passaggi operativi per caratterizzare i monociti....................................................................................................................... 11
Passaggi operativi per caratterizzare i globuli rossi.................................................................................................................. 11
Pannelli consigliati per una corretta analisi dei Cloni PNH..................................................................................................... 13
Refertazione del test citometrico............................................................................... 15
Quali dati inserire nel referto...................................................................................................................................................... 15
La diagnosi citometrica............................................................................................................................................................... 15
Monitoraggio del clone nel tempo............................................................................. 17
L’evoluzione del clone.................................................................................................................................................................... 17
Letteratura consigliata............................................................................................. 20
Principi generali
Emoglobinuria Parossisitica Notturna e Clone PNH
La PNH e l’ancora GPI
L’Emoglobinuria Parossistica Notturna è un disordine ematologico acquisito, derivante dall’espansione non maligna di una
o più cellule staminali ematopoietiche che hanno subìto una mutazione a carico del gene PIG-A, presente sul cromosoma X. La proteina codificata dal gene PIG-A è un enzima essenziale per la sintesi del glicosil-fosfatidil-inositolo
(GPI), molecola che a sua volta funge da sistema di ancoraggio per numerose proteine presenti sulla superficie cellulare.
Come conseguenza della mutazione, le cellule staminali colpite e la loro progenie esprimono difetti totali o parziali delle
proteine ancorate alla membrana mediante il GPI (dette proteine GPI-linked).
Caratterizzazione della PNH
Dal punto di vista ematologico, un Clone PNH è l’insieme di cellule derivate da una singola cellula staminale che ha subìto
una mutazione nel gene PIG-A.
Dal punto di vista citometrico, un Clone PNH è l’insieme di cellule che vengono identificate da un deficit di espressione di almeno
due proteine GPI-linked (oppure da un deficit dell’ancora GPI e di una proteina GPI-linked), su almeno due popolazioni cellulari.
È importante ricordare poi alcuni concetti fondamentali: nello stesso paziente può essere presente un solo Clone PNH
(evenienza più frequente) o due cloni (più raramente); l’identificazione del Clone PNH si ottiene osservando l’istogramma
di fluorescenza relativo all’espressione delle singole proteine GPI-linked: le molecole non espresse, o espresse in modo
chiaramente difettivo, testimoniano la presenza del clone (Figura 1). Nel 2005 è stato proposto dall’International PNH
Interest Group (I-PIG) uno schema classificativo della PNH, che prevede tre principali categorie di malattia (Tabella 1).
Tipico istogramma citometrico relativo all’espressione di CD59 sugli eritrociti di un paziente affetto da PNH.
Figura 1
Notare la chiara distribuzione bimodale del picco, in cui si apprezza, a
destra, una popolazione che esprime l’antigene ad alta densità (cellule
normali) e a sinistra una popolazione nettamente difettiva per l’antigene
(cellule PNH). In alcuni casi è possibile la presenza di un picco intermedio,
che testimonia l’esistenza di un secondo clone, e dunque di una seconda
mutazione.
Tabella 1
Classificazione clinico-citometrica della PNH.
Tipo
Emolisi
intravascolare
Stato del
midollo osseo
Dimensione del
clone PNH
PNH classica
Florida:
emoglobinuria
macroscopica
Midollo iper- o normo-cellulato
con iperplasia eritroide; alterazioni
morfologiche lievi o assenti
Grande,
usualmente >50%
PNH nel contesto di un’altra patologia
con insufficienza midollare
(es. anemia aplastica)
Da lieve a moderata: emoglobinuria macroscopica
intermittente o assente
Evidente insufficienza midollare
Variabile,
usualmente <30%
PNH subclinica, nel contesto di un’altra
patologia con insufficienza midollare
(es. anemia aplastica)
Assenza di emolisi/emoglobinuria sia clinica che
biochimica
Evidente insufficienza midollare
Piccola,
usualmente <1%
3
Lo scopo di questa classificazione è duplice: innanzitutto fornire una terminologia adatta a descrivere i differenti livelli di
presentazione della malattia; in secondo luogo far comprendere che la presenza del Clone PNH è il requisito indispensabile
sul quale costruire una diagnosi di PNH, ma che da sola essa non consente di formulare una diagnosi clinica definitiva in
assenza di informazioni come l’emolisi e la presenza di insufficienza midollare.
Caratterizzazione citometrica della PNH
L’obiettivo della caratterizzazione citometrica di un paziente con sospetta PNH è quindi l’identificazione di uno
o, meno frequentemente, più Cloni PNH. Le principali molecole GPI-linked presenti sulle cellule ematopoietiche
e potenzialmente utilizzabili nella caratterizzazione fenotipica del sangue periferico in un paziente con PNH sono
riportate nella Tabella 2. Da sottolineare che nella Tabella 2 non sono stati inclusi i linfociti né le piastrine in
quanto privi di valore diagnostico.
Tabella 2
Principali molecole da identificare per un’accurata identificazione del Clone PNH.
Cellule
Molecole
Reagenti citati dalla letteratura
(nel caso degli anticorpi monoclonali è riportato il nome del clone)
Globuli rossi
CD59
MEM-43, P282E, p282 [H19], VJ1/12.2
Granulociti neutrofili
CD24
ALB9, ML5
Monociti
CD14
MFP9, RMO52,
Granulociti neutrofili e Monociti
Ancora GPI
FLAER
Tra le molecole alternative, che non sono suggerite dalla Tabella 2, ma che sono ancora oggi riportate largamente in letteratura, ricordiamo CD55 per i globuli rossi, CD16 e CD66b per i granulociti, CD48 e CD55
per i monociti. La scelta del clone anticorpale da utilizzare come reagente per svelare la presenza di una proteina
GPI-linked è molto importante come mostrato in Figura 2.
Nella Figura 2 si introduce anche la nomenclatura per definire cellule normali e cellule di derivazione clonale
nella PNH: la sigla PNH-I indica le cellule normali; la sigla PNH-III indica le cellule francamente patologiche
(ossia totalmente difettive per l’ancora GPI); la sigla PNH-II indica le cellule con un’espressione intermedia
dell’ancora, che fanno parte, ove presenti, di un secondo clone, portatore di una seconda mutazione. Suggeriamo
di quantificare la quota PNH II solo in presenza di un chiaro picco intermedio; sebbene il picco PNH-II sia sostenuto da una mutazione diversa, le dimensioni globali della componente clonale saranno il risultato della somma
di PNH-II e PNH-III. Nei casi riportati nella Figura 2, in realtà l’area PNH-II delimita, più che un vero e proprio
picco, un plateau di passaggio fra PNH-III e PNH-I.
Pur essendo dedicata agli anticorpi monoclonali, la Tabella 2 contiene il suggerimento di usare il FLAER
(Fluorescent Aerolysin) come sistema indicatore della presenza o assenza dell’ancora GPI; si tratta di una tossina
Reattività di differenti cloni anticorpali rivolti contro il CD59, coniugati con lo stesso fluorocromo (PE).
Figura 2
Si noti quanto i cloni VJ1/12.2 e MEM-43
offrano una risoluzione del segnale positivo
(PNH-I) dal negativo (PNH-III) perfetta.
In questo caso si nota l’assenza di un picco
PNH-II.
A
B
4
batterica inattivata, che ha l’interessante proprietà di legarsi all’ancora di GPI, e dunque è un validissimo reagente
capace di identificare in un sol colpo la presenza o l’assenza di tutte le molecole GPI-linked. Purtroppo questa
molecola non è utilizzabile sui globuli rossi, in quanto essi sono sprovvisti dell’enzima indispensabile per attivare
la funzione di legame dell’aerolisina. È da considerare come reagente di riferimento per la ricerca citometrica di
un Clone PNH in granulociti e monociti.
Grazie alla sua sensibilità, consente di identificare cloni di piccole dimensioni. Nelle mielodisplasie, condizioni in
cui già di per sé possono mancare molecole GPI-linked, il FLAER permette di identificare con certezza la presenza di un Clone PNH. La popolazione PNH-II è più facilmente rilevabile, ove presente, sui globuli rossi, sebbene
l’introduzione del FLAER potrà permettere di evidenziare anche la componente granulocitaria del Clone PNH-II.
Nella Figura 3 è mostrato un tipico istogramma della reazione del FLAER con i granulociti neutrofili, in un paziente con PNH. Come si può osservare, è presente una minoranza di cellule normali, FLAER-positive, accanto ad
una maggioranza di cellule PNH, FLAER-negative.
Tipico istogramma citometrico relativo all’espressione dell’ancora GPI (visualizzata mediante il reagente FLAER) sui
granulociti neutrofili, in un paziente affetto da PNH.
Figura 3
Notare, a destra, la popolazione dei neutrofili normali (PNH-I), e (a sinistra) la popolazione dei neutrofili completamente difettivi per l’ancora
GPI (PNH-III).
Lo spazio presente al centro, fra i due picchi, può ospitare, in alcuni pazienti, un’altra popolazione, detta PNH-II, caratterizzata da un difetto parziale
dell’ancora. Ove presenti simultaneamente, le popolazioni PNH-III e PNHII testimoniano la coesistenza di due Cloni PNH. In questa figura manca il
Clone PNH-II.
In quali pazienti eseguire il test citometrico
Il test citofluorimetrico per la PNH dovrebbe essere considerato un test di screening nelle seguenti situazioni:
•
nelle anemie aplastiche;
•
nelle anemie emolitiche Coombs-negative;
•
in pazienti con emoglobinuria macroscopica o biochimicamente rilevabile;
•
in tutti i casi di insufficienza midollare di citopenia idiopatica;
•
nelle citopenia refrattarie con displasia unilineare o multilineare;
•
nei casi di trombosi (arteriose o venose) in sedi atipiche, come ad esempio la sindrome di Budd-Chiari, le
trombosi intra-addominali (vene mesenteriche e porta), le trombosi delle vene cerebrali.
Il test citofluorimetrico per la PNH va considerato nelle seguenti situazioni di follow-up:
•
per il monitoraggio della PNH florida, classica;
•
per il monitoraggio dei Cloni PNH nell’Anemia Aplastica e nelle sindromi mielodisplasiche.
A che cosa serve il test citometrico
Il test citometrico rappresenta l’esame gold-standard nell’identificare un Clone PNH, caratterizzato dall’assenza (totale o
parziale) delle molecole GPI-linked. L’identificazione del Clone PNH rappresenta il requisito indispensabile per la diagnosi
di PNH. In assenza di un clone documentato, non è possibile porre diagnosi di PNH.Tuttavia, in presenza del clone, vanno
prese in considerazione le tre possibili condizioni riportate in Tabella 1.
Quale cut-off utilizzare
Al momento non esistono cut-off points per separare le tre entità cliniche riportate nella Tabella 1, che pertanto
vengono distinte, data come prerequisito l’esistenza del clone, sulla base della presenza dell’emolisi/emoglobinuria
e presenza dell’insufficienza midollare.
5
6
Descrizione del metodo
Fase preanalitica
1. Informazioni rilevanti sul paziente che ci accingiamo a studiare
a. se ha ricevuto trasfusioni o ha presentato episodi emolitici recenti;
b. se il paziente è alla diagnosi o in corso di monitoraggio;
c. i valori dell’emocromo funzionali all’analisi citometrica (numero assoluto di eritrociti, granulociti neutrofili e
monociti);
d. eventuali terapie specifiche in corso.
2. Caratteristiche del campione
a. prelievo di 3-4 ml di sangue periferico in eparina o EDTA o ACD;
[nota: non deve essere utilizzato il sangue midollare, in quanto la presenza di cellule immature a fenotipo
complesso può costituire un elemento fuorviante. Un test citometrico per la PNH deve essere semplice e
riproducibile, e dunque il sangue periferico è il tessuto ideale su cui lavorare.]
b. il test va eseguito possibilmente entro le 24 ore.
[nota: in casi particolari (paziente distante, richieste di consulenza) al massimo entro 48 ore.]
Fase analitica
Quali cellule
Il test di base va eseguito sui granulociti neutrofili e sugli eritrociti; in caso di presenza del clone, l’analisi va estesa
ai monociti, che costituiscono anche un test di conferma, all’interno dei leucociti.
Quale sensibilità
La preparazione dei campioni deve essere eseguita in relazione al livello di sensibilità che si desidera ottenere; defininiamo 3 livelli di sensibilità della tecnica:
•
bassa (limite di sensibilità 1%, ossia una cellula PNH su 100 cellule normali);
•
media (limite di sensibilità 0,1%, ossia una cellula PNH su 1.000 cellule normali);
•
alta (limite di sensibilità 0,01%, ossia una cellula PNH su 10.000 cellule normali). In teoria, acquisendo elevati
numeri di cellule ed in particolari condizioni di ottimizzazione della lettura citometrica, è possibile scendere
al di sotto di questa soglia. Tuttavia, l’identificazione di cloni inferiori a 10-4 è priva, al momento, di significato
clinico e non va segnalata.
Quello che cambia nelle tre metodologie è il numero di cellule che devono essere acquisite al citometro nello specifico
gate. Per ottenere un’alta sensibilità bisogna acquisire cellule con un’elevata numerosità, e ciò è possibile solo per alcune
popolazioni cellulari: eritrociti e, nei casi non marcatamente citopenici, granulociti; difficilmente per i monociti saranno
possibili rilevazioni ad alta sensibilità.
Il numero minimo di eventi da acquisire al citometro nel gate specifico, per ciascun livello di sensibilità, è definito dal
numero minimo di eventi che consente di individuare un cluster di cellule patologiche (PNH) pari o superiore a
30 (valore che è ritenuto il numero minimo di cellule che definisce un cluster significativo). Ad esempio: per identificare
una popolazione PNH pari all’1% avremo bisogno di acquisire almeno 3.000 eventi nel gate (30x100 = 3.000).
Allo stesso modo, per identificare una popolazione PNH pari allo 0,01% avremo bisogno di acquisire almeno 300.000
eventi nel gate (30x10.000 = 300.000).
7
In presenza di situazioni borderline (es. un cluster di 29 cellule PNH su 300.000 eventi acquisiti nel gate), il clone va refertato
come “assente”. In presenza di analoghe situazioni borderline, in cui però il target di 300.000 eventi acquisiti non è stato
raggiunto (es. un cluster di 29 cellule su 290.000 eventi acquisiti nel gate), l’esame, pur essendo suggestivo per la presenza di
un clone pari a 10-4, deve essere refertato come “non conclusivo” e ripetuto in occasione del successivo prelievo ematico.
Come già detto, per i monociti è pressoché impossibile acquisire il numero di eventi richiesti per una determinazione ad
alta sensibilità. Nelle citopenie più marcate è virtualmente impossibile acquisire il numero richiesto per l’alta sensibilità
anche per i granulociti. Al contrario, per gli eritrociti è sempre possibile una determinazione ad alta sensibilità.
La popolazione che meglio riflette le dimensioni del Clone PNH è quella dei granulociti, in quanto gli eritrociti PNH possono
risultare sottostimati a causa di eventuali emotrasfusioni ricevute o della presenza di emolisi intravascolare (vedi fase preanalitica).
Applicando i tre diversi approcci di sensibilità a quanto indicato in Tabella 1 si ottiene che una PNH classica, caratterizzata
dall’espansione di un Clone PNH al di sopra del 50%, può essere identificata utilizzando la tecnica a bassa sensibilità, mentre una PNH subclinica, in cui il Clone PNH è generalmente minore dell’1%, richiede una tecnica maggiormente sensibile.
Risulta ovvio che le sensibilità indicate sono quelle a cui tendere nell’analisi: si potrebbe infatti non arrivare alle sensibilità
indicate a causa della scarsa cellularità dei campioni, come ad esempio nelle citopenie marcate.
Tabella 3
Sensibilità da utilizzare nei vari sospetti diagnostici.
Linea Cellulare
Sospetto
Monociti
Granulociti
Eritrociti
Anemia Aplastica
Citopenia Idiopatica
Insufficienza midollare
Sindrome Mielodisplastica (MDS)
Bassa/Media
Media/Alta
Alta
Anemia Emolitica (Coombs-negativa)
Emoglobinuria
Trombosi AA/VV in sedi atipiche
Bassa/Media
Media
Media
Sospetto non dichiarato
Bassa/Media
Media
Media
Esempio 1: livelli di sensibilità nell’analisi dei granulociti
Poniamo il caso di un paziente che presenti, nel sangue periferico, 103 granulociti/µl:
1.
Sensibilità dell’1%. Eseguendo un test standard, ossia utilizzando 50µl di sangue periferico e marcandoli con anticorpi
monoclonali, abbiamo a disposizione potenzialmente 50.000 granulociti. Considerando che la tecnica suggerita prevede un
lavaggio in PBS, il valore di 50.000 è solo teorico, in quanto bisogna considerare i granulociti persi con il lavaggio (approssimativamente il 50%). Nonostante ciò, è estremamente semplice raggiungere il target di 3.000 eventi nel gate granulocitario.
2.
Sensibilità dello 0,1%. Per acquisire 30.000 eventi nel gate sarà necessario allestire n.1 tubo contenente 100μl di sangue
periferico, oppure n.2 tubi, ciascuno contenente la quantità standard di 50µl di sangue periferico. In tal modo la disponibilità cellulare teorica sarà di 100.000 granulociti neutrofili. Dopo il lavaggio saranno ancora disponibili 50.000 granulociti neutrofili. Di questi, 30.000 dovranno essere acquisiti nel gate. Ovviamente, prima dell’acquisizione, qualora si
fossero utilizzati due distinti tubi di reazione, le cellule presenti nei due tubi, devono essere riunite in un’unica provetta.
3.
Sensibilità dello 0,01%. Per acquisire 300.000 eventi sarà necessario allestire n.1 tubo (sufficientemente capiente per
ospitare anche la soluzione di lisi) contenente 1ml di sangue periferico, oppure frazionare la reazione in un numero di
tubi tale che ciascuno contenga la quantità di sangue periferico necessaria per raggiungere la quota di 1ml totale. (es.
5 tubi contenenti 200μl di sangue periferico). In tal modo la disponibilità cellulare teorica sarà di 1.000.000 granulociti
neutrofili. Dopo il lavaggio saranno ancora disponibili 500.000 granulociti neutrofili. Di questi, 300.000 dovranno essere
inclusi nel gate. Ovviamente, prima dell’acquisizione, qualora si fossero utilizzati diversi tubi di reazione, le cellule presenti nei distinti tubi, devono essere riunite in un’unica provetta.
Appare chiaro che, limitatamente ai granulociti neutrofili, una soglia di sensibilità dello 0,1% sembra facilmente raggiungibile, mentre
quella dello 0,01% appare impegnativa. Più facile sarebbe stato se il nostro paziente avesse presentato non 103, ma 2x103 o 3x103
granulociti neutrofili/µl.
8
Tecniche a diversa sensibilità per l’analisi di piccoli Cloni PNH all’interno della popolazione di granulociti neutrofili.
(nell’esempio: paziente con 103 granulociti neutrofili/µl).
Tabella 4
Sensibilità
richiesta
Numero minimo
di granulociti
neutrofili nel gate
Numero minimo
di granulociti
neutrofili PNH
Quantità di
sangue periferico
necessario
Commento
1%
3.000
30
50µl
Semplice
0,1%
30.000
30
100µl
Facilmente raggiungibile
0,01%
300.000
30
1.000µl
Impegnativa
Esempio 2: livelli di sensibilità nell’analisi degli eritrociti
Poniamo il caso di un paziente che presenti, nel sangue periferico, 3x106 eritrociti/µl:
1.
Sensibilità dell’1%. Eseguendo un test standard, ossia utilizzando 50µl di sangue periferico diluito 1:500 e marcando con
anticorpi monoclonali, abbiamo a disposizione potenzialmente 300.000 eritrociti. Considerato che la tecnica suggerita prevede un lavaggio in PBS, il valore di 300.000 è solo teorico, in quanto bisogna considerare gli eritrociti persi con il lavaggio.
Tuttavia, raggiungere il target di 3.000 eventi nel gate eritrocitario è estremamente semplice.
2.
Sensibilità dello 0,1%. Per avere invece 30.000 eventi nel gate sarà necessario allestire n.1 tubo contenente la quantità
standard di 50µl di sangue periferico diluito 1:500. In tal modo la disponibilità cellulare teorica sarà di 300.000 eritrociti.
Dopo il lavaggio saranno ancora disponibili almeno 150.000 eritrociti. Di questi, 30.000 dovranno essere inclusi nel gate.
3.
Sensibilità dello 0,01%. Per avere 300.000 eventi sarà necessario allestire n.1 tubo contenente 150μl di sospensione eritrocitaria precedentemente diluita 1:500. In tal modo la disponibilità cellulare teorica sarà di 900.000 eritrociti. Dopo il lavaggio
saranno ancora disponibili almeno 450.000 eritrociti. Di questi, 300.000 dovranno essere inclusi nel gate.
Appare chiaro che, limitatamente agli eritrociti, tutte le soglie di sensibilità sembrano facilmente raggiungibili.
Tecniche a diversa sensibilità per l’analisi di piccoli Cloni PNH all’interno della popolazione di eritrociti.
(nell’esempio: paziente con 3x106 eritrociti/µl).
Tabella 5
Sensibilità
richiesta
Numero minimo
di granulociti
neutrofili nel gate
Numero minimo
di granulociti
neutrofili PNH
Quantità di
sangue periferico
necessario
Commento
1%
3.000
30
50µl di sangue
previamente diluito 1:500
Semplice
0,1%
30.000
30
50µl di sangue
previamente diluito 1:500
Semplice
0,01%
300.000
30
I50µl di sangue
previamente diluito 1:500
Facilmente raggiungibile
9
Passaggi operativi per caratterizzare i granulociti neutrofili
1. Risospendere accuratamente il campione di sangue prelevato al paziente.
2. Prelevare la quantità adeguata di sangue del paziente (vedi esempio 1, pagina 8) ed incubarla accuratamente in
provette da citometria oppure di maggiori dimensioni ove indicato, evitando ogni difetto di mixing (Figura 4)
fra campione e reagenti, con appropriate quantità di ogni anticorpo monoclonale o di FLAER.
3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia esclusa dalla reazione.
4. Incubare per 30min a 4°C, al buio (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).
5. Lisare miscelando l’aliquota di sangue periferico con soluzione di cloruro di ammonio in rapporto di 1:20-1:40.
6. Agitare sul vortex e lasciare lisare a temperatura ambiente per 10min.
7. Centrifugare a 2.000rpm per 3min in una centrifuga da banco.
8. Allontanare delicatamente il sovranatante (meglio se per aspirazione) e risospendere in 200-300μL di PBS, o
comunque nella minima quantità di tampone idonea per la lettura al citometro.
9. Acquisire almeno 3.000 eventi nel gate granulocitario, nella tecnica a sensibilità standard, 30.000 nella tecnica
a sensibilità intermedia e 300.000 eventi nella tecnica ad alta sensibilità.
Note
•
Non sono necessari campioni normali di controllo.
•
Non sono necessari controlli anticorpali isotipici.
Un errore di mescolamento del sangue del paziente con gli anticorpi monoclonali può portare ad una falsa misura
del Clone PNH, dovuta all’esclusione di parte del campione dalla miscela di reazione.
A
B
C
D
E
F
Figura 4
Il pannello A mostra come una parte del campione resti esclusa dalla reazione con gli anticorpi. I pannelli B e C mostrano la comparsa
di un falso picco PNH, dovuto ad una mancanza di contatto fra cellule ed anticorpi. I pannelli D, E ed F mostrano la maniera corretta
di svolgere il test, ponendo grande attenzione al mixing di cellule e reagenti.
10
Passaggi operativi per caratterizzare i monociti
1. Risospendere accuratamente il campione di sangue prelevato al paziente.
2. Prelevare 50µl del sangue del paziente e incubarli accuratamente in provette da citometria, evitando ogni
difetto di mixing fra campione e reagenti, con appropriate quantità di ogni anticorpo monoclonale o di FLAER
(Figura 5).
3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia esclusa dalla reazione.
4. Incubare per 30min a 4°C, al buio (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).
5. Lisare con 2mL di soluzione di cloruro di ammonio.
6. Agitare sul vortex e lasciare lisare a temperatura ambiente per 10min.
7. Centrifugare a 2.000rpm per 3min in una centrifuga da banco.
8. Allontanare delicatamente il sovranatante (meglio se per aspirazione) e risospendere in 200-300μL di PBS, o
comunque nella minima quantità di tampone idonea per la lettura al citometro.
9. Acquisire almeno 3.000 eventi nel gate, se possibile. Per i monociti non viene richiesta l’alta sensibilità.
Note
•
Non sono necessari campioni normali di controllo.
•
Non sono necessari controlli anticorpali isotipici.
Un esempio di doppia marcatura dei monociti con anticorpo anti CD14 marcato in APC-Cy7 e con FLAER marcato
con Alexa488.
Figura 5
Una minoranza di cellule è positiva per CD14 e per FLAER. La grande maggioranza è negativa per CD14 e FLAER. Da notare la piccola popolazione
FLAER+/CD14-, da considerare normale, data la ben nota caratteristica del
CD14 di essere negativo su una piccolissima frazione di monociti periferici.
Passaggi operativi per caratterizzare i globuli rossi
Procedura standard
1. Diluire il campione di sangue periferico con PBS (1:500) per ottenere una sospensione di globuli rossi.
2. Prelevare 50μl della sospensione ottenuta ed incubarli accuratamente in provette da citometria, evitando ogni
difetto di mixing (Figura 6) fra sospensione e reagenti, con appropriate quantità di ogni anticorpo monoclonale.
3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia esclusa dalla reazione.
4. Incubare per 30min a 4°C, al buio (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).
5. Lavare con 2mL di PBS a 2.000rpm per 3min in una centrifuga da banco.
6. Allontanare delicatamente il sovranatante (meglio se per aspirazione) e risospendere in 200-300μL di PBS, o
comunque nella minima quantità di tampone idonea per la lettura al citometro.
7. Acquisire almeno 3.000 eritrociti nel gate per la tecnica standard, 30.000 per la tecnica a sensibilità intermedia,
300.000 per la tecnica ad alta sensibilità.
11
Dimostrazione di come un errore di mescolamento del campione con i reagenti possa portare alla falsa identificazione di un Clone PNH. Il pannello C mostra una falsa popolazione PNH (vedi anche legenda in Figura 4).
A
B
C
D
E
F
Figura 6
Procedura alternativa “no wash”
Da utilizzare solo dopo aver verificato l’accettabilità del segnale di background dei reagenti utilizzati ed eventualmente aver titolato i reagenti stessi.
1. Diluire il campione di sangue periferico con PBS (1:50) per ottenere una sospensione di globuli rossi.
2. Prelevare 10μl della sospensione ottenuta ed incubarli accuratamente in provette da citometria, evitando ogni
difetto di mixing fra sospensione e reagenti, con appropriate quantità di ogni anticorpo monoclonale.
3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia esclusa dalla reazione.
4. Incubare per 30min a 4°C, al buio (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).
5. NON Lavare.
6. Risospendere in 200-300μL di PBS, o comunque nella minima quantità di tampone idonea per la lettura al citometro.
7. Acquisire almeno 3.000 eritrociti nel gate per la tecnica standard, 30.000 per la tecnica a sensibilità intermedia,
300.000 per la tecnica ad alta sensibilità.
Nota
La tecnica no-wash presuppone che gli anticorpi utilizzati, pur in assenza di lavaggio, diano un segnale di fondo su cellule
negative per l’antigene accettabilmente basso. Non tutti gli anticorpi coniugati con fluorocromi hanno la capacità, in un
sistema no-wash, di mostrare un alto “segnale” e un basso “disturbo”. Nel campo della PNH il sistema no-wash va preliminarmente testato su di un campione con PNH florida in cui il CD59 deve essere in grado di evidenziare, pur in assenza
di lavaggio, la presenza di distinti picchi di fluorescenza relativi alle popolazioni normali e PNH. In un sistema no-wash
“sotto controllo” la distanza in canali di fluorescenza tra il picco PNH-I ed il picco PNH-III deve essere sufficientemente
ampia da poter ospitare, ove presente, un picco PNH-II.
12
Pannelli consigliati per una corretta analisi dei Cloni PNH
Riportiamo nella seguente sequenza di tabelle, i pannelli di reagenti consigliati per una corretta diagnosi della PNH.
Viene considerata la possibilità di disporre, nel proprio laboratorio, di un citofluorimetro da 3 a 7 parametri di fluorescenza (Tabelle 6-10 e Figure 7-10). Per isolare la popolazione da studiare, vengono utilizzati i marcatori cosiddetti di
gating, cioè quei marcatori non legati all’ancora GPI e quindi sempre espressi sia in assenza che in presenza del Clone
PNH. Per la scelta dei fluorocromi valgono le regole generali di combinare i marcatori più deboli (es. CD33) con il fluorocromo più efficiente (es. R-PE).
Tabella 6
Pannello consigliato per un citofluorimetro a tre colori.
Linea cell.
FL1
FL2
FL3
Strategia di gating
Granulociti
FLAER (CD66b)
CD24
CD15
CD15 vs SSC
FSC vs SSC
Monociti
FLAER
CD33
CD14
CD33 vs SSC
FSC vs SSC
Eritrociti
CD59
GPA
CD45
FSC-log vs SSC-log
GPA vs CD45
Tabella 7
Pannello consigliato per un citofluorimetro a quattro colori.
Linea cell.
FL1
FL2
FL3
FL4
Strategia di gating
Granulociti
FLAER (CD66b)
CD24
CD15
CD33
CD15 vs CD33
Monociti
FLAER
CD33
CD14
CD45
CD45 vs SSC
Eritrociti
CD59
GPA
CD45
FSC vs SSC
CD33 vs SSC
FSC-log vs SSC-log
FSC vs SSC
GPA vs SSC
Tabella 8
Pannello consigliato per un citofluorimetro a cinque colori.
Linea cell.
FL1
Granulociti
e monociti
FLAER
(CD66b)
FL2
FL3
FL4
FL5
Strategia di gating
CD15 vs CD33
CD24
CD15
CD33
FSC vs SSC
(granulociti)
CD14
CD45 vs SSC
CD33 vs SSC
FSC vs SSC
(monociti)
Eritrociti
CD59
GPA
CD45
FSC-log vs SSC-log
GPA vs SSC
Tabella 9
Pannello consigliato per un citofluorimetro a sei colori.
Linea cell.
FL1
Granulociti
e monociti
FLAER
(CD66b)
FL2
FL3
FL4
FL5
FL6
Strategia di gating
CD15 vs CD33
CD24
CD15
CD33
CD14
CD45
CD45 vs SSC
FSC vs SSC
(granulociti)
CD45 vs SSC
CD33 vs SSC
FSC vs SSC
(monociti)
Eritrociti
CD59
GPA
CD45
FSC-log vs SSC-log
GPA vs SSC
Tabella 10
Pannello consigliato per un citofluorimetro a sette colori.
Linea cell.
FL1
Granulociti
e monociti
FLAER
(CD66b)
FL2
FL3
FL4
FL5
FL6
FL7
Strategia di gating
CD15 vs CD33
CD24
CD15
CD33
CD14
CD45
CD64
CD45 vs SSC
FSC vs SSC
CD33 vs CD64
FSC vs SSC
(granulociti)
CD45 vs SSC
(monociti)
Eritrociti
CD59
GPA
CD45
FSC-log vs SSC-log
13
GPA vs SSC
Strategie di gating
Strategia di gating da utilizzare per isolare i globuli rossi.
Figura 7
Vengono consigliati, per un’analisi standard, a bassa sensibilità, i parametri
fisici (FSC-log e SSC-log). Nelle analisi in cui è richiesta un’alta sensibilità
(anemie aplastiche, mielodisplasie, in assenza di emoglobinuria) si consiglia
di affiancare ai parametri fisici l’uso del CD45 (i globuli rossi devono risultare 100% negativi) e della glicoforina A (GPA, che deve risultare 100%
positiva).
Strategia di gating da utilizzare per isolare i monociti.
Figura 8
La più semplice strategia di gating per isolare i monociti: CD33 vs SSC. Si
consiglia di perfezionare l’identificazione dei monociti attraverso l’uso dei
parametri fisici FSC e SSC.
Figura 9
Strategia di gating da utilizzare per isolare i granulociti.
Per i granulociti, gli utilizzatori di questo panel dovrebbero utilizzare una
strategia di gating a due colori (CD33 vs CD15), eventualmente perfezionata con i parametri fisici, che consentono di escludere con accuratezza gli
eventi apoptotici o necrotici.
Figura 10
Esempio di strategia a due colori (CD45 e CD33) per l’identificazione dei monociti.
A
B
14
Refertazione del test citometrico
Quali dati inserire nel referto
I dati minimi ritenuti essenziali per una corretta interpretazione del referto citometrico da parte del clinico, e che quindi
formano il set minimo di dati da fornire nel referto oltre alle informazioni sul paziente e sul campione, sono i seguenti:
•
diagnosi citometrica con relativo commento indicativo;
•
linee cellulari studiate nell’analisi;
•
numero di eventi nei gate specifici con indicazione del livello di sensibilità raggiunto;
•
strategie di gating utilizzate;
•
marcatori GPI-linked/molecole analizzate;
•
% cellule negative (EPN III), % cellule parzialmente negative (EPN II), % cellule normali (EPN I) per ogni marcatore GPI-linked/molecola analizzata;
•
dimensioni del clone (sommando EPN II + EPN III).
Notare che nel referto si parla di popolazioni EPN I-II-III mentre nel testo di queste raccomandazioni esse sono state
denominate PNH-I-II-III; questo per facilitare la lettura ad una utenza di clinici italiani.
Sarebbe poi auspicabile, se tecnicamente possibile, inserire nel referto anche una figura con un citogramma caratteristico
che meglio mostri i risultati dell’analisi.
La diagnosi citometrica
Alla conclusione del test sono possibili quattro situazioni, da riportare fedelmente nel referto come “diagnosi citometrica” (non clinica) e relativo commento indicativo.
1. Clone EPN assente. L’analisi citometrica non ha evidenziato la presenza di un clone indicativo di Emoglobinuria Parossistica Notturna.
2. Clone EPN rilevato. L’analisi citometrica mostra la presenza di un Clone EPN [dire chiaramente in quali
popolazioni il clone è stato identificato]. Questo risultato è compatibile con Emoglobinuria Parossistica Notturna. Le eventuali differenze di dimensioni del clone tra globuli bianchi e globuli rossi possono essere dovute
a emolisi e/o trasfusioni.
3. Clone EPN di piccole dimensioni. L’analisi citometrica mostra la presenza di un clone <1% di cellule
EPN sulla popolazione di riferimento (granulociti).Tale risultato non è compatibile con una diagnosi di Emoglobinuria Parossistica Notturna florida e va interpretato alla luce del quadro clinico-laboratoristico e midollare
del paziente (possibile EPN subclinica associata a disordine midollare, quale anemia aplastica o mielodisplasia).
Si consiglia monitoraggio periodico.
4. Dati non conclusivi per uno dei seguenti motivi:
a. eccessiva mortalità cellulare;
b. scarsa cellularità;
c. non idonea conservazione o anticoagulazione del campione.
15
Viene mostrato in questa figura un esempio di referto clinico in cui viene riportato il caso di un paziente in cui vi è
la chiara presenza di un grosso Clone PNH.
Si notino le indicazioni di:
•
diagnosi citometrica con commento;
•
sensibilità usata per la tecnica;
•
strategia di gating utilizzata;
•
% EPN-I , % EPN-II, % EPN-III;
•
dimensione del clone (somma di EPN-II ed EPN-III).
16
Figura 11
Monitoraggio del Clone PNH nel tempo
Nelle tre condizioni cliniche descritte nella Tabella 1, la citometria svolge un ruolo rilevante nel monitoraggio delle dimensioni del clone nel tempo. In genere, la ricerca e quantizzazione del Clone PNH deve essere ripetuta ogni 6 mesi.
Il monitoraggio nel tempo ha la funzione di chiarire la storia naturale del clone.
Per pazienti con evidenza clinica di emolisi (PNH classica oppure anemia aplastica/PNH) si raccomanda, alla diagnosi, di
studiare sia gli eritrociti che i granulociti.
Ottenuta la diagnosi, si raccomanda di ripetere l’analisi ogni 6 mesi, per due anni, e poi annualmente se il quadro si stabilizza. Se c’è evidenza di progressione clinica, o al contrario, di miglioramento, è indicato effettuare analisi più frequenti.
Per pazienti con anemia aplastica o mielodisplasia senza evidenza di emolisi, alla diagnosi è indicato effettuare un’analisi
citometrica ad alta sensibilità su eritrociti e granulociti. Il test va ripetuto poi annualmente, anche in assenza di evidenza
clinica di emolisi (compresi i pazienti in trattamento immunosoppressivo).
L’evoluzione del Clone PNH
Rispetto al monitoraggio del clone nel tempo, sulla base del modello della dual pathogenesis, che prevede una condizione
di insufficienza midollare sottostante/precedente all’insorgenza del Clone PNH, sono state descritte cinque possibili
tipologie di pazienti (Figura 12).
a. Pazienti affetti da insufficienza midollare nei quali rapidamente insorge un Clone PNH che progressivamente
si espande, risolvendo l’insufficienza midollare.
b. Pazienti affetti da insufficienza midollare duratura nei quali dopo lunga latenza insorge un Clone PNH che
progressivamente si espande, risolvendo l’insufficienza midollare.
c. Pazienti affetti da insufficienza midollare nei quali insorge un Clone PNH che prima si espande, risolvendo
l’insufficienza midollare, e successivamente si estingue, riportando il paziente alla condizione esistente prima
dell’insorgenza del clone.
d. Pazienti affetti da insufficienza midollare nei quali insorge un Clone PNH che prima si espande, risolvendo
l’insufficienza midollare, e successivamente si estingue. Fortunatamente, in parallelo all’estinzione del clone,
l’emopoiesi normale riprende a ripopolare il midollo osseo, risolvendo il problema dell’insufficienza midollare.
e. Pazienti in corso di un’insufficienza midollare, nei quali il Clone PNH resta a livelli minimi.
17
Figura 12
Possibili evoluzioni del Clone PNH
Legenda
Rosa = le cellule ematopoietiche normali
Blu = il Clone PNH
Rosa carico = area di sovrapposizione fra blu e rosa
18
19
Letteratura consigliata
1. Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R, Hillmen P, Luzzatto L, Young N, Kinoshita T,
Rosse W, Socié G; International PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2005 Dec 1;106(12):3699-709. Epub 2005 Jul 28.
2. Boccuni P, Del Vecchio L, Di Noto R, Rotoli B. Glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored molecules and the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Crit Rev Oncol Hematol. 2000 Jan;33(1):25-43. Review. PubMed
PMID: 10714960.
3. Battiwalla M, Hepgur M, Pan D, McCarthy PL, Ahluwalia MS, Camacho SH, Starostik P, Wallace PK. Multiparameter flow cytometry for the diagnosis and monitoring of small GPI-deficient cellular populations. Cytometry B Clin
Cytom. 2010 Sep;78(5):348-56. doi: 10.1002/cyto.b.20519. Epub 2010 Jun 7. PubMed PMID: 20533383; PubMed
Central PMCID: PMC2937167.
4. Borowitz MJ, Craig FE, Digiuseppe JA, Illingworth AJ, Rosse W, Sutherland DR,Wittwer CT, Richards SJ; Clinical
Cytometry Society. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related
disorders by flow cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 2010 Jul;78(4):211-30. PubMed PMID: 20533382.
5. Sutherland DR, Kuek N, Azcona-Olivera J, Anderson T, Acton E, Barth D, Keeney M. Use of a FLAER-based
WBC assay in the primary screening of PNH clones. Am J Clin Pathol. 2009 Oct;132(4):564-72. PubMed PMID:
19762534.
6. Luzzatto L, Bessler M. The dual pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Curr Opin Hematol. 1996
Mar;3(2):101-10. Review. PMID: 9372059.
7. Li Y, Li X, Ge M, Shi J, Qian L, Zheng Y,Wang J. Long term follow-up of clonal evolution in 802 aplastic anemia patients:
a single-center experience. Ann Hematol 2011;90:529-37.
8. Pu JJ, Mukhina G,Wang H, Savage W, Brodsky RA. Natural history of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones in
patients presenting aplastic anemia. European Journal of Haematology 2011;87:37-45.
9. Jankowska AM, Szpurka H, Calabro M, Mohan S, Schade AE, Clemente M, Silverstein RL, Maciejewski JP. Loss of
expression of neutrophil proteinasi-3: a factor contributing to thrombotic risk in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
Haematologica 2011; 96(7):954-62.
20
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