I risultati delle analisi dipendono dal metodo analitico utilizzato;
pertanto occorre associare ad ogni criterio microbiologico un
metodo di riferimento specifico.
Tuttavia, gli operatori del settore alimentare devono avere la
possibilità di usare metodi d’analisi diversi dai metodi di
riferimento, in particolare quelli più rapidi, a condizione che
tramite tali metodi alternativi si ottengano risultati equivalenti.
Reg. (CE) 2073, punto 24 delle considerazioni preliminari
MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
TECNICHE COLTURALI ALTERNATIVE
• Substrati cromogeni per attività enzimatiche
- genere-specifiche[C 4 esterasi per Salmonella sp]
- specie-specifiche [ glucuronidasi per E. coli, fosfolipasi C per L. monocytogenes]
• Terreni colturali disidratati, selettivi e non
Vantaggi
 Economia e praticità
Limitazioni
 Comparabilità con i metodi
colturali di riferimento
(validazione secondo ISO
16140:2003)
 Elevata specificità per i cromogeni

Interferenza del substrato
alimentare
ALOA Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti
Selettivo e differenziale per L. monocytogenes
AGENTI SELETTIVI
 LITIO CLORURO
 ACIDO NALIDIXICO
AGENTI DIFFERENZIALI
• X-GLUCOPIRANOSIDE
ß-glucosidasi
 CEFTAZIDIME
 CICLOEXIMIDE
COLONIE VERDE-BLU
 POLIMIXINA B
• SUBSTRATO PER
FOSFOLIPASI (fosfatidilinositolo)
fosfolipasi
COLONIE VERDE -BLU CON ALONE OPACO
I principi del terreno ALOA
(Agar Listeria di Ottaviani ed Agosti)
Colonia blu
verde:
Alone opaco:
attività beta
glucosidasica
attività fosfolipasica
Listeria sp.
L. monocytogenes
AGAR LISTERIA acc. to OTTAVIANI & AGOSTI
ALOA - COLONIE
CARATTERISTICHE
Listeria monocytogenes: colonie verdi-blu con alone opaco
Listeria non monocytogenes: colonie verdi-blu senza alone
L.
innocua
L. monocytogenes
Coltura mista di L. monocytogenes (minoritaria) ed
L. innocua (maggioritaria) su OXFORD (dx),
PALCAM (sx) ed ALOA (centro)
MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
TECNICHE IMMUNOLOGICHE
•
Per la ricerca di microrganismi (precedentemente coltivati) tramite anticorpi
specifici marcati con enzimi attivi su substrati cromogenici (ELISA) o fluorogenici
(ELFA) oppure coniugati con particelle di lattice in sistemi analitici che sfruttano la
migrazione per capillarità su supporti permeabili (immunocromatografia, lateral flow).
Vantaggi
 Velocità di risposta
Limitazioni
 Variabile densità cellulare
per la rilevazione del segnale
enzimatico
 Possibile automazione
 Possibile interferenza del
substrato alimentare
•
Per la ricerca e quantificazione, con i medesimi principi (ELISA, ELFA, LA Latex
Agglutination nella versione Reverse Passive, ovvero RPLA), di metabolici batterici
e fungini.
MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
TECNICHE IMMUNOLOGICHE
Vantaggi
Limitazioni
 Economia e praticità
 Sensibilità variabile secondo
la fonte commerciale ed il
substrato alimentare
 Rapid Test Performance
Evaluation Program (GIPSA)
 Possibili interferenze del
substrato alimentare
Possibile uso delle colonne di immunoaffinità e della tecnica
immunomagnetica (IMS o ICS) per la “pulizia” del campione e
per la concentrazione dell’analita cercato
MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
TECNICHE STRUMENTALI
•
Dirette, con misurazione della biomassa in mezzi colturali liquidi, selettivi e non:
biofotometria, optofluorimetria
•
Dirette, con misurazione di un costituente cellulare:
bioluminometria (ATP)
•
Indirette, con misurazione degli effetti del metabolismo microbico sullo stato
fisico del mezzo di prova:
impedometria (modificazione della conducibilità elettrica)
Vantaggi
 Velocità di risposta
Limitazioni
 Correlazione con i metodi
colturali di riferimento
 Possibile automazione
 Interferenza del substrato
alimentare
Log(CFU/MI) = 9,240 – 0,388*DT
Correlation Coef. (R): -0,97
CBT MACINATI
10
9
8
Log CFU
7
6
5
4
3
2
1
0
0
6
12
Detection Time (Hours)
18
24
MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
TECNICHE GENETICHE
•
Biologia molecolare per ridurre i tempi di rilevazione ed aumentare il grado
di affidabilità tassonomica:
- ibridazione degli acidi nucleici (riconoscimento di una sequenza bersaglio del
microrganismo ricercato tramite l’aggiunta di una sonda nucleica che ha una
sequenza complementare)
- amplificazione del DNA (RNA) bersaglio tramite l’enzima polimerasi (PCR) e
misura dinamica della reazione di ibridazione (RT PCR: Real Time PCR).
Vantaggi
 Velocità di risposta
Limitazioni
 Contaminazioni incrociate
(ambienti, operatori, manualità)
 Sensibilità
 Inibitori dell’enzima polimerasi
 Specificità
 Sequenza bersaglio speciespecifica
MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
TECNICHE GENETICHE
•
Biologia molecolare per i bersagli non coltivabili o difficilmente coltivabili con
mezzi convenzionali:
- RT-PCR per virus ( es. nei molluschi).
•
Biologia molecolare per la tipizzazione molecolare (impronta genetica) degli stipiti
isolati in luoghi, momenti e processi diversi di una filiera produttiva:
- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) su operons di r RNA
(ribotipizzazione)
- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
- PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)