PROBLEMI EMERGENTI NELLA
VALUTAZIONE DEL RISCHIO
MICROBIOLOGICO
Prof. Antonello Paparella
Dipartimento di Scienze degli Alimenti
Università degli Studi di Teramo
Cremona, 15 ottobre 2004
2002: ICMSF (International Commission on
Microbiological Specifications for Foods)
Transizione dai sistemi HACCP alla QRA
(Analisi quantitativa del rischio)
solo per problemi sanitari rilevanti
e matrici alimentari complesse
applicazione integrata di HACCP,
QRA e GHP
ridimensionamento e qualificazione
del controllo ufficiale
definizione
degli
Obiettivi
sicurezza alimentare (FSO)
di
FSO
(Food Safety Objective)
massima frequenza e/o carica di
microorganismi
sanitario
o
di
interesse
concentrazione
di
tossine al momento del consumo
Evoluzione del mercato degli alimenti: da
unbranded commodities a convenience foods
Tendenze nella tecnologia alimentare:
applicazione estensiva di tecnologie in
nuovi settori (merchandising)
Estensione della vita di scaffale (ESL)
Mild technologies (minimally processed
foods)
Innovazione tecnologica:
nuovi rischi microbiologici?
Salagione per microiniezione in prodotti
non trattati termicamente
Innovazione tecnologica:
nuovi rischi microbiologici?
Semilavorati critici: carni separate
meccanicamente, prodotti ricomposti,
prodotti semicotti, ecc.
Innovazione tecnologica:
nuovi rischi microbiologici?
Distributori automatici di piatti pronti
Innovazione tecnologica:
nuovi rischi microbiologici?
Ricottina al Fumo di Ginepro biologica del Parco
Forma intera (peso minimo 300 gr)
Ricottina al Fumo di Ginepro biologica del Parco
€ 7,00
Forma intera (peso minimo 300 gr)
AGGIUNGI IL PRODOTTO AL CARRELLO
OPPURE ALLA LISTA DELLA SPESA
Vendita in rete di prodotti deperibili
Valutazione del rischio microbiologico:
impatto della biodiversità dei microrganismi
QRA: richiede piani sperimentali mirati
allo studio della sopravvivenza/sviluppo di
specifici ceppi microbici
Scelta dei ceppi: condiziona il rapporto
tra valori predetti e valori misurati
Mild technologies: la risposta dei
microrganismi ai danni subletali può
essere notevolmente diversa tra ceppi e
individui
Sopravvivenza ai processi della tecnologia
alimentare: patogeni ad elevata classe di rischio
VTEC (E. coli verocitotossico o SLT): sopravvivenza a pH
3,9 (sidro, salame, maionese, ecc.)
SINDROME UREMICA EMOLITICA
INSUFFICIENZA RENALE ACUTA IN ETA’ PEDIATRICA
Dose infettante: 1 ufc g
(ICMSF, 2002)
–1
Ricontaminazione post processo: patogeni emergenti
Enterobacter sakazakii: contaminazione
alimenti a bassa aw (latte in polvere)
di
MENINGITE E SETTICEMIA NEL NEONATO
rara ma letale (tasso letalità 33-80%)
segnalata correlazione epidemiologica con
latte in polvere
Kandhai et al 2004: positività 9-35% in
campioni ambientali da 100% stabilimenti
di produzione (n=4). Positività 31% in
campioni prelevati da 16 nuclei familiari.
Contaminazione di alimenti consumati crudi
Vibrio vulnificus in OSTRICHE: può diventare vitale non
coltivabile (VNC) senza perdere la virulenza (Olivier and
Bockian 1995)
Abbattimento Viable Count dopo riduzione temp. a 5°C: 6D
Carica effettiva: >1 x 105 VNC ml-1
Prova biologica positiva (topo)
Effetto ac.citrico 1-10% e succo limone 50-100% (Borazjani
et al 2003): abbattimento 4D ma sopravvivono >3 MPN g-1
Ieri patologia professionale
Oggi tossinfezione alimentare
Tendenzialmente ribelle al trattamento
“Patologie da frigorifero”
Listeria monocytogenes
SPORADICA
in
CASI
DI
LISTERIOSI
Canada (Farber et al 2000) – Nel frigorifero dei 2
pazienti: contaminazione da L.m. sierotipo 1/2b in surimi,
olive nere, insalata di pasta, ragù e maionese.
Surimi: 2,1 x 109 ufc g-1
Olive nere: 1,1 x 107 ufc g-1
Insalata di pasta: 1,3 x 106 ufc g-1
Correlazione epidemiologica con surimi
Olive nere substrato non permissivo…
…MA CONTAMINATO!!
Rischi derivanti da innovazioni tecnologiche
Siringatura per microiniezione e
biodiversità di L.monocytogenes
nel salmone affumicato
Paparella et al 2003
SIRINGATURA PER
MICROINIEZIONE
Possibile
fonte
contaminazione
da
di
L.
monocytogenes, a causa
del
ricircolo
salamoia
della
e/o
della
formazione di biofilm
(soprattutto
in
prodotti
non destinati a cottura!!)
BIODIVERSITA’ DI LISTERIA MONOCYTOGENES
Gli stress applicati all’ecosistema microbico
esaltano le differenze di comportamento tra gli isolati
Non tutti gli isolati
manifestano
stesso
lo
potenziale
di sopravvivenza e
sviluppo!!!!
Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine:
industria del salmone) a 6°C in due substrati:
BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee tratteggiate)
Paparella et al 2003
Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine:
industria del salmone) a 9°C in due substrati:
BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee tratteggiate)
Paparella et al 2003
Effetto dell’aggiunta di estratto di lievito (3% in SBm3;
10% in SBm10) al Brodo di Salmone (SB): ceppo LM16
Growth of L. monocytogenes LM16 at 10°C in BHI, SBs, SBm3, SBm10
1,4
1,2
1,0
D.O.
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
SBm10
SBm3
SBs
BHI
Time (hours)
Paparella et al 2004
Biodiversità in isolati di L.monocytogenes provenienti
dall’industria del salmone
M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 M
M 17 18 19 22 23 M 24 25 26 27 28 M 29 30 31 32 33 34 M
M 35 36 37 38 39 M 42 43 44 45 46 47 48 49 50 M
M e 7 = ceppi ATCC
CEPPI SALAGIONE TRADIZIONALE: 50 (2103 b1), 39 (2103 b4), 26 (2103 b6)
CEPPI MICROINIEZIONE: 31 (641/7 I), 13 (648/2 I), 48 (648/7 I)
CEPPI AMBIENTALI: 34 (LM 16), 29 (LM37)
Paparella et al 2004
BIODIVERSITA’ NELLA DIVERSITA’
Valutazione della sopravvivenza di una
popolazione di L.monocytogenes in un
prodotto con fisiologica eterogeneità
merceologica
(Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)
EFFETTO MATRICE NEI PRODOTTI A BASE DI CARNE IMPANATI
PREFRITTI: RUOLO DEL GRASSO (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)
Figure 1 – Evolution of dynamometric index and survival curves of Listeria monocytogenes
inoculated in poultry meat added with different percentages of fat and collagen
7
EFFETTO MATRICE NEI PRODOTTI A BASE DI CARNE IMPANATI
PREFRITTI: RUOLO DEL COLLAGENE (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)
Figure 2a – Survival curves of Listeria
monocytogenes inoculated in poultry meat
added with 8% fat and 3% collagen
Figure 2b – Survival curves of Listeria
monocytogenes inoculated in poultry meat
added with 8% fat and 6% collagen
7
I LIMITI DELL’ESAME BATTERIOLOGICO:
LE CELLULE VITALI NON COLTIVABILI
Cellule VNC: condizione di vitalità con
perdita di coltivabilità (viable not
culturable)
Strategia di sopravvivenza in batteri
non sporigeni. Dimostrata in Salmonella,
Campylobacter,
Escherichia,
Vibrio,
Streptococcus, Micrococcus ma anche in
sporigeni come Bacillus subtilis.
Riduzione
volumetrica
da
forme
coccobastoncellari a piccoli corpi sferici
non dotati di involucri.
TRANSIZIONE DA VNC
A COLTIVABILE E VICEVERSA
Passaggio a VNC indotto da: carenza di
nutrienti, cambiamenti di temperatura
(es. refrigerazione), esposizione ad
ipoclorito o modificazioni nella % NaCl.
Ripristino
della
coltivabilità
(“resuscitation”): può essere indotto da
un aumento della temperatura o da un
graduale incremento della % nutrienti
(NO TERRENO DI ARRICCHIMENTO!).
Alla ricerca delle VNC…
Metodi per stimare la vitalità cellulare
DEFT (Jakobsen et al 1984; Ruocco et al 1991)
Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et al 1999)
Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et al 1997)
Bioscreen/Turbidometria(Phillips et al 1998;Paparella et al 2003)
CO2 detection time in GC (Guerzoni et al 1985)
Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)
METODO DEFT
(Direct Epifluorescence Filter Technique)
Principio:
i
microorganismi,
filtrati
su
membrana,
trattati
con
fluorocromo
ed
osservati in epifluorescenza, assumono colore in
funzione di RNA e permeabilità della parete
Utilizzando l’arancio di acridina, le cellule vitali
assumono una colorazione giallo-arancio mentre
quelle inattivate appaiono verdi
METODO DEFT
Parametro:
n° cellule in almeno 15 campi microscopici
U.M.:
numero DEFT (batteri vitali)
Tempo
di analisi: 30 min
Sensibilità
(con risposta lineare):5 x 103-1 x 104ufc g-1
Correlazione
con metodi tradizionali: R=0,89 (Ruocco,
1991), R=0,99 (Jakobsen, 1984)
Varianti:
manuale ed automatico
DEFT:BIOFILM DI LISTERIA MONOCYTOGENES
Studio del danno acido e termico in
L.monocytogenes con citometria di flusso
(Petrova and Donnelly 2004)
DOPPIA COLORAZIONE:
Carbossifluoresceina diacetato (cFDA)
Propidio ioduro (PI)
attività esterasica
danno di membrana
L.monocytogenes, esposta a diversi trattamenti termici e acidi,
si divideva in 3 sottopopolazioni:
VITALE: cFDA-positiva
DANNEGGIATA: PI-positiva e cFDA-positiva
INATTIVATA: PI-positiva
Studio del danno da olio essenziale in
L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et al 2004)
AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO:
Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile)
formazano (rosso, insolubile)
Valutazione quantitativa della vitalità cellulare (deidrogenasi)
- usata in studi di fisiologia vegetale -
Numerosi ceppi di L.monocytogenes sono stati esposti a diverse
% olii essenziali. La Minimal Inhibitory Concentration (MIC) è
stata valutata, in un primo screening, con TTC.
Studio del danno da olio essenziale in
L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et al 2004)
Paparella et al 2004
BIOCONSERVAZIONE DEGLI
ALIMENTI
Tecnologie per la prevenzione della
contaminazione e dello sviluppo di
microrganismi
negli
alimenti,
attraverso l’uso di:
 sostanze antimicrobiche naturalmente
presenti negli alimenti
 sostanze antimicrobiche prodotte
negli alimenti dopo stimolazione
fisica o chimica, oppure in seguito
all’aggiunta di colture microbiche
protettive
Colture protettive
Colture microbiche che possono essere
aggiunte agli alimenti al fine di inibire
microrganismi
modificare
indesiderati,
le
senza
caratteristiche
tecnologiche e sensoriali del prodotto
Invece, nelle colture starter, la
modificazione delle caratteristiche
fisico-chimiche è desiderata
Inibizione da LAB verso L. monocytogenes
Valutazione dell’antagonismo tra LAB e Listeria
monocytogenes (tutti isolati da salmone affumicato)
LAB
Listeria monocytogenes
641/6 II
2103 b1
2103 b6
648/7 II
641/7 I
648/2 I
A 202
A 203
A 205
A 211
A 213
B 202
B 213
LAT 5
LAT 7
LAT 8
LAT 12
++
++
+++
+++
+
++
++
++
++
+++
+++
++
++
+++
+++
+++
++
++
++
+++
++
++
++
+++
+++
+++
+++
LAT 15
+
+++
LAT 16
++
LAT 22
659/4III
++
+++
++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+++
+++
++
+++
+++
++
++
-
++
+++
+++
++
++
++
++
++
++
+++
++
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
++
-
++
++
+++
++
++
+++
++
++
++
++
++
-
-
+++
LAT 28
+++
++
+
++
++
++
+++
LAT 31
+++
+++
++
++
++
++
++
LAT33/2
+++
+
++
++
+
++
++
LAT 35
+++
++
++
++
+++
++
++
LAT 38
+++
++
++
++
+++
+++
+++
LAT 40
+++
++
+++
+++
+++
-
++
Paparella et al 2003
BIOCONSERVAZIONE CON OLII ESSENZIALI
In genere: NO Residui tossici SI Modifica sensoriale
Interesse verso olii dearomatizzati o efficaci a bassa conc.
Meccanismo di azione non sempre conosciuto
Componenti idrofobici di alcuni olii essenziali possono
oltrepassare la parete dei Gram neg. attraverso le porine
(Helander et al 1998) per poi modificare la permeabilità di
membrana con effetti letali (Lambert et al 2001)
Azione selettiva degli estratti vegetali
Effetto inibente dell'estratto acquoso di origano
12
LOG UFC/ml
10
8
S.warneri
L.monoc.
S.aureus
6
4
2
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Quantità fenoliche
Paparella et al 2004
Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su
differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al 2004)
12
11
S. aureus
S. sapro phyticus
S. xylo sus
S. warneri
10
9
8
7
log cfu m L
-1
6
5
4
3
2
1
0
0
0 .0 0 0 3 6
0 .0 0 0 72
0 .0 0 18
0 .0 0 2 52
0 .0 0 3 6
0 .0 10 8
0 .0 18
0 .0 2 52
0 .0 3 6
conce ntr ation (%)
Influence of sage EO on the survival of Staphylococcus spp.
Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su
differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al 2004)
12
11
S. aureus
S. sapro phyticus
S. xylo sus
S. warneri
10
9
8
7
log cfu m L -1
6
5
4
3
2
1
0
0
0.00036
0.00072
0.0018
0.00252
0.0036
0.0108
0.018
0.0252
0.036
conce ntration (%)
Influence of rosemary EO on the survival of Staphylococcus spp.
Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su
differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al 2004)
Time
(min)
0
1
30
60
90
120
S. aureus
S. warneri
S. xylosus
S. saprophyticus
Sage
Rosemary
Sage
Rosemary
Sage
Rosemary
Sage
Rosemary
7.32  0.60*
5.01  0.36
2.51  0.06
NVC**
NVC
NVC
7.32  0.60
4.04  0.12
NVC
NVC
NVC
NVC
7.30  0.28
4.14  0.18
2.05  0.03
1.12  0.12
NVC
NVC
7.30  0.28
5.10  0.19
3.00  0.51
NVC
NVC
NVC
7.50  0.04
4.09  0.14
1.20  0.36
NVC
NVC
NVC
7.50  0.04
5.00  0.25
NVC
NVC
NVC
NVC
7.60  0.15
4.03  0.11
2.99  0.22
NVC
NVC
NVC
7.6  0.15
5.12  0.19
NVC
NVC
NVC
NVC
*Mean  SD.; **No viable cell growth was detected (detection limit: 10 cfu mL-1)
CONCLUSIONI
QRA:
richiede
ingenti
risorse
economiche ed un notevole sviluppo
culturale delle imprese alimentari
L’innovazione
tecnologica
può
risolvere oppure creare nuovi rischi
alimentari
CONCLUSIONI
La gestione dei rischi alimentari
deve
fare
i
conti
con
la
biodiversità dei microrganismi
Sarebbe necessario promuovere la
collezione e caratterizzazione dei
ceppi microbici più significativi per
la produzione alimentare (utili –
degradativi –patogeni)
CONCLUSIONI
La
bioconservazione
degli
alimenti può offrire interessanti
opportunità
per
sostenibile
della
alimentare
uno
sviluppo
tecnologia
Grazie
per l’attenzione!