METODO STANDARD HPA
RICERCA E CONTEGGIO
DI
LISTERIA MONOCYTOGENES
ED ALTRE SPECIE LISTERIA
F 19
Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training
Centre for Infections
RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA
Revisione no: 3 Data di revisione: 06.01.09 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training in collaborazione con
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
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Riferimeto no: F 19i3
Questo MNS deve essere usato congiuntamente agli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency
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STATO DEI METODI STANDARD NAZIONALI
I Metodi Standard Nazionali, che includono le procedure operative standard (SOPs), algoritmi e note guida,
promuovono prestazioni di elevata qualità e contribuiscono ad assicurare il confronto delle informazioni
diagnostiche ottenute da laboratori diversi. Ciò facilita la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla
ricerca, sviluppo e controllo, promovendo nel contempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie
strutture sanitarie. Questi metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard per la microbiologia
clinica e la salute pubblica. Tuttavia, utilizzando i Metodi Standard Nazionali, i laboratori devono tener conto
delle necessità locali e possono richiedere di intraprendere ricerche addizionali. Questi metodi forniscono inoltre
un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
I Metodi Standard Nazionali sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con un ampio processo di
consultazione in cui le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in considerazione ed i documenti elaborati
riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo è presente sulla pagina iniziale,
sono membri dei gruppi di lavoro che hanno sviluppato i Metodi Standard Nazionali. L’inclusione del logo di una
organizzazione nella prima pagina implica il sostegno per gli obiettivi e le procedure volte alla predisposizione
dei metodi standard. Questi rappresentanti partecipano allo sviluppo dei Metodi Standard Nazionali ma le loro
opinioni non sono necessariamente quelle dell’insieme dell’organizzazione di cui sono membri. L’elenco
aggiornato delle organizzazioni partecipanti può essere ottenuto inviando una e-mail a [email protected]
La prestazione dei metodi standard dipende dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure dei prova
commerciali o messi a punto in loco. I laboratori devono garantire che queste siano state validate e che siano
idonee allo scopo prefissato. Devono anche essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la
Health Protection Agency non può essere ritenuta responsabile dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi
conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste
procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che operano in questo settore
nel Regno Unito, pertanto, se necessario, si dovrà ricorrere ad altri consulenti. Se si apportano modifiche a
questa pubblicazione, devono essere omessi tutti i riferimenti alla Health Protection Agency. La Health
Protection Agency (HPA) dovrebbe in ogni caso essere informata
La Health Protection Agency è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della
popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali.
Informazioni più dettagliate possono essere trovate sul sito www.hpa.org.uk.
La Health Protection Agency è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive
Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di
informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di
sicurezza1.
Maggiori informazioni possono essere ottenute sul sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo
sviluppo dei documenti sono possibili contattando [email protected].
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modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà
aggiornata automaticamente.
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2009). Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes and other Listeria
species. National Standard Method F 19 Emissione 3
http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA
Revisione no: 3 Data di revisione: 06.01.09 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training in collaborazione con
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INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD .......................................................................................
2
INDICE ........................................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA .....................................................................................................................
4
INTRODUZIONE .......................................................................................................................................
5
1 PRINCIPIO .........................................................................................................................................
6
2 DEFINIZIONI .......................................................................................................................................
6
3 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..........................................................................................
6
4 ATTREZZATURA ..............................................................................................................................
7
5 TERRENI DI COLTURA......................................................................................................................
7
6 PROCEDIMENTO SUL CAMPIONE …..............................................................................................
9
6.1
6.2
6.3
6.4
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER LA RICERCA ………………………………………………………...
9
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER IL CONTEGGIO ……………….……………………………………… 10
RICONOSCIMENTO E CONTEGGIO DELLE COLONIE ……………….……………………………………… 10
PROVE DI CONFERMA ……………………………………………………………………………………… 10
7 CALCOLO DEI RISULTATI .... ..........................................................................................................
12
8 REFERTAZIONE DEI RISULTATI ......................................................................................................
12
9 STRUTTURE DI RIFERIMENTO .......................................................................................................
13
10 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ........................................................................................................
13
APPENDICE 1: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI RILIEVO E
CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA ….............................
14
APPENDICE 2 COFRONTRA FRA MEDODO F19 ED ISO 11290 PARTE 1 E 2 …….....…………….… 16
BIBLIOGRAFIA .........................................................................................................................................
17
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento
controllato
Titolo del documento
controllato
F 19
Ricerca e conteggio di Listeria monocytogenes e dI altre specie
Listeria
Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di
questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento
controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio.
Modifica
Numero/
Dat
a
6/
06.01.09
Emissione
no.
Scartata
Inserita
Emissione
no.
2
3
Pagina
Sessione(i)
interessate
Modifica
5
Conoscenza
di base
La proposta relativa al volume per il
conteggio è stata allargata per
comprendere 0.5 mL per piastra da
90mm.
8
Terreni di
coltura
Terreno cromogenico CLA sostituito
con agar Listeria cromogenico con
codicillo che specifica la possibilità di
utilizzo di altri terreni cromogenici se
dimostrati equivalenti.
Aggiunto agar oxford come seconda
piastra di agar selettivo per il metodo
di ricerca.
10
Sezione 6.4.2 Riferimento all’uso della luce UV è
stato trasferito nella nota informativa
spiegando che può essere utilizzato.
Citazione del riferimento ISO rimosso
per chiarezza.
Appendice 2
Inserito confronto fra i metodi della
HPA ed ISO.
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RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA
MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA
INTRODUZIONE
Scopo
Il presente metodo descrive la ricerca e il conteggio di Listeria monocytogenes e di altre specie Listeria ed è
applicabile a tutte le matrici alimentari, compresi i prodotti lattiero-caseari ed i tamponi ambientali.
In generale, il limite inferiore di conteggio di questo metodo è di 1 ufc per millilitro di campione di prodotto
liquido, o 10 ufc per grammo di campione per gli altri prodotti.
Conoscenza di base
La legislazione Europea che prescrive i principi di sicurezza alimentare riguardanti L. monocytogenes2 è
divenuta operativa in Inghilterra l’11.1.063. Queste direttive prevedono l’assenza del microrganismo in 25 g
di campione o livelli inferiori a 100 unità formanti colonia (ufc) per grammo durante tutto il periodo di
conservazione degli alimenti pronti all’uso. Concentrazioni di L. monocytogenes superiori alle condizioni di
sicurezza alimentare devono essere considerate legalmente insoddisfacenti. Da parte dei produttori di
alimenti pronti all’uso, con possibile rischio per la salute pubblica di L. monocytogenes, esiste inoltre, per la
ricerca di questo microrganismo, l’esigenza di inserire nei loro programmi di campionamento i controlli
prelevati dalle aree di produzione alimentare e dalle attrezzature2.
Le vigenti linee guida della PHLS/HPA per la maggior parte degli alimenti pronti all’uso4 contengono principi
di indirizzo per tutte le specie Listeria. Il riscontro di specie Listeria diverse dalla L. monocytogenes
suggerisce la probabile presenza di L. monocytogenes in altre parti del lotto alimentare o nell’ambiente. I
campioni che contengono più di 100 ufc/g di altre specie Listeria sono considerati insoddisfacenti e la loro
presenza a concentrazioni maggiori richiede accertamenti.
La verifica del livello di contaminazione in questi prodotti alimentari è eseguita con il conteggio diretto su
terreni selettivi solidi. In alcuni alimenti pronti all’uso, quali formaggi molli stagionati, paté e confezioni
sottovuoto o in atmosfera modificata di carni cotte a lunga conservazione, la presenza di Listeria è dovuta
principalmente alla capacità del microrganismo di moltiplicarsi durante la conservazione refrigerata ove
raggiunge concentrazioni significative. Per questi alimenti è richiesta una ulteriore procedura di
arricchimento per determinare la presenza o assenza del microrganismo in una determinata quantità di
alimento.
Il metodo descritto si avvale della BS EN ISO 11290 parti 1 e 25, 6. Per la ricerca ed il conteggio di L.
monocytogenes a livello internazionale sono riconosciuti metodi equivalenti. Si utilizza un terreno di
isolamento cromogenico che per azione della E-glucosidasi presente in questi batteri consente lo sviluppo
delle specie Listeria con formazione di colonie blu-verdi. La successiva differenziazione fra le specie è
ottenuta con la prova del fosfatidilinositolo o lecitina7-9; con loro idrolisi enzimatica prodotta dalla fosfolipasi
di L. monocytogenes e L. ivanovii e formazione di alone opaco attorno alla colonia; nessun altra specie
Listeria produce un alone opaco attorno alla colonia.
Questo Metodo differisce dalle vigenti ISO 11290-1 e 11290-2 (che comprendo l’Emendamento No. 1:2004)
per un certo numero di dettagli di minor importanza. Entrambi i metodi ISO sono comunque in revisione. Le
differenze significative fra le procedure descritte nella F19 e quelle dei metodi ISO revisionati includono il
volume da seminare per il conteggio sull’agar che nella F19 è di 0.5 mL per piastre da 90 mm invece di 0.1
mL (o di 1 mL su tre piastre da 140 mm) e F19 descrive pure l’uso del sistema API per ’identificazione, che
non è compreso nello standard corrente, ma è inserito nella bozza della ISO 11290. L’elenco più dettagliato
delle differenze è disponibile nell’Appendice 2.
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1
PRINCIPIO
Negli alimenti o tamponi che richiedono prove per presenza/assenza o quando può essere
significativo un numero ridotto di microrganismi, la ricerca di L. monocytogenes e di altre specie di
Listeria richiede l’arricchimento primario a 30°C per 24 ore in brodo selettivo contenete metà della
concentrazione di acido nalidixico e acriflavina. A questo segue un arricchimento secondario nello
stesso brodo selettivo contenente gli agenti selettivi a concentrazione intera ed incubazione a 37°C
per 48 ore. Eseguire isolamenti su due agar selettivi da entrambi i brodi di arricchimento. Questi
agar selettivi sono esaminati per verificare la presenza di tipiche colonie e l’identificazione delle
specie tramite le caratteristiche morfologiche e le prove biochimiche.
Con questo metodo il conteggio di L. monocytogenes e delle altre specie di Listeria è ottenuto
seminando sulla superficie di un terreno selettivo un volume definito del campione alla diluizione
10-1 e di altre appropriate diluizioni decimali. Le piastre cromogeniche di agar Listeria sono incubate
a 37°C per 48 ore. Il calcolo del numero di ufc per grammo o mL di campione di L. monocytogenes
e di altre specie di Listeria è ottenuto dal numero di colonie tipiche cresciute sul terreno selettivo,
confermato in seguito dalle caratteristiche morfologiche e dalle prove biochimiche.
2
DEFINIZIONI
Nel contesto di questo metodo si applicano le seguenti definizioni:
Specie Listeria
Microrganismo che sviluppa tipiche colonie sui terreni selettivi solidi, e che presenta le
caratteristiche morfologiche e biochimiche descritte in questo metodo.
Listeria monocytogenes
Microrganismo conforme alla precedente definizione di specie Listeria, presenta di solito E-emolisi
su agar sangue di cavallo e produce acido dal ramnosio, ma non dallo xilosio, presenta reazione
negativa alla prova DL-alanina E-naftilamide (DIM) dopo aggiunta del reagente ZIM B usando la
confezione API Listeria.
Ricerca di L. monocytogenes e di altre specie di Listeria
Determinazione della presenza o assenza di questi microrganismi in un determinato peso o volume
di alimento o di prodotto lattiero caseario, o in campione ambientale.
Conteggio di L. monocytogenes e di altre specie di Listeria
Determinazione del numero di questi microrganismi per grammo o mL di alimento o prodotto
lattiero-caseario.
3
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA10-12
Applicare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. Le lavoratrici in gravidanza o
presunte tali, devono essere esentate dalla manipolazione di colture note di Listeria
monocytogenes. Lo ZIM B è tossico e può indurre infertilità e causare danneggiamento nei bambini
non nati L’infezione causata in gravidanza dalla Listeria è rara ma può determinare complicanze in
funzione del trimestre di acquisizione dell’infezione, compresi aborto ed infezione neonatale.
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4
ATTREZZATURA
Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere:
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
5
Bilancia con sensibilità di 0.1 g
Stomacher
Diluitore gravimetrico (opzionale)
Miscelatore Vortex
Piastratore a spirale (opzionale)
Termostati a 30°C r1°C, 37°C r1°C
Contatore colonie (opzionale)
Microscopio a luce normale: obiettivo 40x
Buste per Stomacher (sterili)
Pipettatori automatici e relativi puntali sterili in grado di erogare 0,1 mL, 1 mL e 10mL
(opzionale)
Pipette (sterili con rilascio totale) 10mL e 1mL graduate in volumi di 0.1 mL (opzionale)
Spatole (sterili)
Lampada UV (lunghezza d’onda 365 nm)
TERRENI DI COLTURA
Si possono utilizzare terreni commerciali disidratati equivalenti; seguire le indicazioni del produttore.
Diluente peptone salino (DPS - diluente di maggior isolamento)
Peptone
Cloruro di sodio
Acqua
pH 7.0 r0.2 a 25°C
1.0 g
8.5 g
1L
Acqua peptonata tamponata (APT, opzionale)
Peptone
Cloruro di sodio
Sodio fosfato monoacido
Potassio fosfato biacido
Acqua
pH 7.2 r0.2 a 25°C
10.0 g
5.0 g
3.5 g
1.5 g
1L
Diluente citrato di sodio (opzionale)
tri-Sodio citrato biidrato
(Na3C6H5O7.2H2O)
Acqua
pH 7.5 r ҏ0.2 a 25°C
20.0 g
1L
Diluente di-potassio fosfato monoacido (opzionale)
di-Potassio fosfato monoacido
(K2HPO4)
Acqua
pH 7.5 r0.2 a 25°C o 8.4 r0.2 a 25°C
20.0 g
1L
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Brodo di Fraser e Fraser a mezza concentrazione
Fraser
Fraser a mezza
concentrazione
5.0 g
5.0 g
5.0 g
5.0 g
20.0 g
12.0 g
1.35 g
1,0 g
3.0 g
0.5 g
20 mg
25 mg
1L
Peptone della proteosi
5.0 g
Triptone
5.0 g
Estratto di carne
5.0 g
Estratto di lievito
5.0 g
Cloruro di sodio
20.0 g
di- Sodio fosfato monoacido
12.0 g
Potassio fosfato biacido
1.35 g
Esculina
1,0 g
Cloruro di litio
3.0 g
Ammonio citrato ferrico
0.5 g
Acido nalidixico
10 mg
Idrocloruro di acriflavina
12,5 mg
Acqua
1L
pH 7.2 rҏ0.2 a 25°C
Agar sangue di cavallo
Agar Columbia con 5% sangue di cavallo.
Agar Listeria Cromogenici (quali: OCLA, ALOA,)7-9(Formulazione ISO)
Nota: per l’isolamento di Listeria possono essere usati altri terreni cromogenici, purché sia
dimostrata equivalenza, ed una completa validazione con la ISO 16140 se la formulazione usata
differisce da quella dichiarata dalla ISO 11290
Digerito di tessuti animali
Digerito enzimatico di caseina
Estratto di lievito
Piruvato di sodio
Glucosio
Glicerofosfato di magnesio
Solfato di magnesio (anidro)
Cloruro di sodio
Cloruro di litio
di-Sodio fosfato monoacido
(anidro)
Lecitina di soia (contenente
almeno 30% di fosfatidilinositolo)
L- Į-Fosfatidilinositolo
ALOA
18.0 g
6.0 g
10.0 g
2.0 g
2.0 g
1.0 g
0.5 g
5.0 g
10.0 g
2.5 g
--------2.0 g
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-E-Dglucopiranoside
0.05 g
Cicloexemide
0.05 g
o Amfotericina B
Sale sodico di acido nalidixico
Ceftazimide
Solfato di Polmixina B
Agar
Acqua
pH 7.2 r0.2 a 25°C
0.01 g
0.02 g
0.02 g
76.700 UI
12 -18.0 g
1L
OCLA
18.0 g
6.0 g
10.0 g
2.0 g
2.0 g
1.0 g
0.5 g
5.0 g
10.0 g
2.5 g
2.0g
----------0.05g
0.01 g
0.02 g
0.02 g
76.700 UI
12 -18.0 g
1L
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Agar selettivo Listeria (Agar oxford)13
Base Columbia agar sangue
Esculina
Ammonio citrato ferrico
Cloruro di litio
Cicloexemide
o Amfotericina B
Solfato di colistina
Acriflavina
Cefotetan
Fosfomicina
Acqua
pH 7.0 rҏ0.2 a 25°C
39.0 g
1.0 g
0.5 g
15.0 g
0.4 g
0.01 g
20.0 mg
5.0 mg
2.0 mg
10.0 mg
1L
Reagenti per colorazione Gram (opzionale)
Confezione commerciale per prove biochimiche – API Listeria e reagente ZYM B (consultare la
sezione 3 per importante nota sulla sicurezza)
6
PROCEDIMENTO SUL CAMPIONE
6.1
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER RICERCA
6.1.1
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E PRE-ARRICCHIMENTO
L’arricchimento è necessario per definire la presenza/assenza in campioni di 25g, tamponi
ambientali e prodotti quali paté e quelli confezionati sotto vuoto o in atmosfera modificata con data
di scadenza prolungata ed alimenti confezionati per bambini di età inferiore a 12 mesi.
Pesare 25 g di campione rappresentativo in una busta sterile per stomacher usando strumenti
sterili ed operando in modo asettico. Omogeneizzare con stomaker in un volume o peso di brodo
Fraser a mezza concentrazione di nove volte superiore. Registrare il peso del campione ed il peso
o il volume del brodo di Fraser utilizzato a mezza concentrazione. Se la quantità del campione
disponibile è inferiore a 25 g o mL mantenere il rapporto campione:diluente a 1:9 (1 in 10).
Per tamponi ambientali, verificare che il tampone sia completamente immerso nel brodo di Fraser a
mezza concentrazione; ottenere una diluizione di circa 1:10. Passare su Vortex o in Stomaker per
portare i microrganismi in sospensione. Trasferire l’omogeneizzato o la sospensione del tampone in
un contenitore dotato di chiusura (come un sacchetto o contenitore con tappo a vite)14.
6.1.2
INCUBAZIONE ED ARRICCHIMENTO
Inserire il brodo di arricchimento primario (Fraser a mezza concentrazione) in termostato a 30
r1°C per 24 r2 ore. Eseguire sottocolture con 0.1 mL del brodo incubato di Fraser a mezza
concentrazione in 10 mL di brodo di Fraser ed inserire in termostato a 37°C r1°C per 48 r2 ore.
6.1.3
SOTTOCOLTURE IN AGAR SELETTIVI
Dopo ҏ24 r 2 ore eseguire dal brodo di arricchimento primario (Fraser a mezza concentrazione)
sottocolture negli agar Listeria cromogenico ed agar oxford. Eseguire sottocolture dal brodo di
arricchimento secondario (Fraser) dopo 48 rҏ2 ore su agar Listeria cromogenico ed in agar oxford.
Incubare entrambi i tipi di piastre seminate in aerobiosi a 37°C r1°C.
Esaminare le piastre per la presenza di colonie tipiche, come descritto nella sezione 6.3, dopo
incubazione di 24 r3 ore e dopo altre 24 r3 ore se necessario.
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6.2
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER IL CONTEGGIO
Seguendo le procedure descritte nel Metodo Standard F 2 (alimenti) o D 1 (prodotti lattiero-caseari),
preparare un omogeneizzato in diluente peptone salino (DPS) alla diluizione 10-1 o in acqua
peptonata tamponata (APT) od altri diluenti idonei (consultare D 1). Se necessario, preparare una
diluizione a 10-3 in DPS. Se la ricerca è limitata alla Listeria, preparare un omogeneizzato a 10-1 in
brodo Fraser non arricchito ed in Fraser arricchito a mezza concentrazione, con supplemento
aggiunto dopo la semina delle piastre di conteggio.
Seminare 0.5 mL della diluizione 10-1 sulla superficie di ciascuna di due piastre di agar Listeria
cromogenico. Diffondere il più presto possibile l’inoculo in modo accurato sulla superficie della
piastra utilizzando una spatola sterile. Se sono attesi conteggi elevati, seminare anche 50 µL delle
diluizioni 10-1 e 10-3 con piastratore a spirale su piastre di agar Listeria cromogenico.
Per consentire l’assorbimento dell’inoculo nell’agar lasciare le piastre sul banco di lavoro per circa
15 minuti. Capovolgerle ed inserirle nel termostato a 37°C r1°C per 24 r3 ore e, se necessario,
per altre 24 r3 ore.
6.3
RICONOSCIMENTO E CONTEGGIO DELLE COLONIE
6.3.1
RICONOSCIMENTO
Esaminare le piastre dopo 24 r3 ore per la ricerca delle colonie tipiche delle specie Listeria. e, se
necessario dopo altre 24 r3 ore.
In corso di ricerche epidemiche l’incubazione delle piastre può essere protratta a 96 ore se non si
manifesta crescita o non compaiono colone tipiche dopo 48 ore15.
Agar Listeria cromogenico
Le colonie di Listreria appaiono di colore blu o blu-verde. Dopo 24 ore le tipiche colonie di L.
monocytogenes sono circondate da un alone opaco che può apparire di debole intensità o a lento
sviluppo se il microrganismo è stressato, in modo particolare da un ambiente acido. Anche i ceppi di L.
ivanovii sviluppano un alone opaco, ma entro 48 ore. Le altre specie di Listeria non producono alone.
Anche altre specie di batteri possono sviluppare colonie di colore blu, quali: Bacillus, Carnobacterium,
stafilococchi, e streptococchi.
Agar Oxord
Dopo 24 ore le colonie di Listeria appaiono piccole, diametro di 1 mm, grigiastre circondate da un alone
nero (esculina positiva). Dopo 48 ore divengono scure, talvolta con lucentezza verdastra, sono di 2 mm
di diametro con alone nero e centro incavato.
6.3.2
CONTA DELLE COLONIE CON METODO DI CONTEGGIO
Per il conteggio utilizzare piastre con più di 150 colonie (se disponibile). Se sulla piastra sono presenti
più di un tipo di colonie eseguire un conteggio differenziato. Se dopo 24 ore sono presenti colonie con
alone eseguire il loro il conteggio perché nel periodo d’incubazione successivo gli aloni possono
incrementare di dimensione e rendere difficile la loro determinazione.
6.4
PROVE DI CONFERMA
6.4.1
SELEZIONE DELLE COLONIE PER CONFERMA
Eseguire la sottocoltura dalla piastra di agar Listeria cromogenico su agar sangue di cavallo di non
più di cinque colonie sospette per ciascun tipo morfologico di Listeria (o tutte quelle che se sono
presenti in numero inferiore a cinque) ed eseguire le prove di conferma come di seguito specificato.
Se nessuna di queste è confermata come L. monocytogenes (assenza di colonie tipiche o le prove
di conferma identificano specie Listeria diverse da L monocytogenes) eseguire le sottocolture di
cinque colonie (o di tutte, se presenti in numero inferiore) da ciascuna delle piastre di sottocoltura
ottenute dai brodi di arricchimento primario e secondario. Esaminare attentamente le differenti
morfologie che si sviluppano, se presenti, eseguire sottocolture almeno di ciascun tipo
rappresentativo.
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Se nessuna di queste colonie è confermata come L monocytogenes ma alcune o tutte sono
confermate come specie Listeria può essere calcolato il conteggio (Sezione 7).
Se la presenza di L. monocytogenes è stata già confermata col conteggio, non è richiesto alcun
altro accertamento sulle sottocolture delle piastra seminate con il brodo di arricchimento, tranne
che in corso di indagine epidemiologica in cui si ricerca uno specifico ceppo.
6.4.2
CONFERMA
Seminare dapprima ogni colonia sospetta di Listeria su agar sangue di cavallo con una sola
infissione (per facilitare il rilievo dell’emolisi) e lo sviluppo di colonie separate, poi con strisci
separati per verificarne la purezza ed ottenere colonie isolate. Incubare a 37°C per 24 r3 ore e
verificare purezza, aspetto morfologico e presenza di ȕ-emolisi. Registrare la tipologia dell’emolisi.
La maggior parte di ceppi di L monocytogenes sono emolitiche.
Ceppi
L. ivanovii sono intensamente emolitiche e L. seeligeri sono debolmente emolitiche Le altre specie,
inclusa L. innocua, non sono emolitiche16,17.
Nota informativa: Alcuni ceppi di L monocytogenes raramente non sviluppano emolisi su agar
sangue di cavallo e, se riscontrati, devono essere inviati al laboratorio di riferimento con allegati i
risultati del sistema di identificazione API.
Per la conferma selezionare colture pure delle colonie a morfologia diversa.
Se richiesto, verificare il tipo di isolato con la colorazione Gram. Le specie Listeria sono Gram
positive, pleiomorfe, a forma di bastoncino sottile, non sporigene e non pigmentate sugli agar
sangue di cavallo.
Per ciascun tipo morfologico eseguire le prove biochimiche con sistema di identificazione API
Listeria seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere il reagente ZYM B. Listeria
monocytogenes presenta reazione negativa alla prova DIM mentre le altre specie sono positive17.
Nota informativa: Il reagente ZYM B è sensibile alla luce e si deteriora rapidamente, fornendo
reazioni falsamente positive. Conservare in condizioni di refrigerazione, proteggere dalla luce ed
abbreviare il più possibile il tempo di permanenza del reagente a temperatura ambiente. Non
superare la data di scadenza raccomandata dal produttore. Alcuni laboratori hanno osservato che
l’esame del DIM sotto luce UV (lunghezza d’onda 365 nm) prima dell’aggiunta del reagente ZIM B
facilita la differenziazione fra i ceppi di L. monocytogenes e le altre specie Listeria. I ceppi di L.
monocytogenes non emettono fluorescenza, mentre le altre specie Listeria manifestano
fluorescenza blu/violetta conseguente alla liberazione di gruppi naftilici (consultare sezione 3 per
informazioni riguardanti la sicurezza nell’uso del reagente ZYM B), Prendere le opportune
precauzioni durante l’uso della luce UV.
I profili API possono essere accettabili, buoni od eccellenti con percentuali d’identificazione • 90%
ed indice T • 0.25.
Registrare l’identificazione dell’isolato. Registrare anche il profilo API, la percentuale di
identificazione e l’indice T.
6.4.4
MICRORGANISMI
DEL CONTROLLO DI QUALITA’
Le procedure del controllo di qualità interno devono essere eseguite secondo le indicazione del
protocollo locale usando i seguenti ceppi di controllo.
Controllo positivo
Controllo positivo
Listeria monocytogenes
Listeria innocua
NCTC 11994
NCTC 11228
Controllo negativo
Enterococcus faecalis
NCTC 775
controllo per agar Listeria cromogenico
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7
CALCOLO DEI RISULTATI
Se è stato eseguito il conteggio, calcolare il numero delle colonie, quando possibile, utilizzando le
diluizioni con crescite non superiori a150 colonie.
Calcolare il numero di specie Listeria o di L. monocytogenes per grammo nel modo seguente:
Conteggio per g = Numero di colonie confermate x
Numero colonie saggiato
8
Numero colonie conteggiato
Volume saggiato x diluizione
REFERTAZIONE DEI RISULTATI
Refertare tutti i microrganismi Listeria, includendo L. monocytogenes come specie Listeria. Se è
stata isolata L. monocytogenes, refertare separatamente quest’ultima.
Se le specie Listeria non sono state isolate con l’arricchimento, refertare come:
“Specie Listeria non rilevate in 25 g o nel tampone”
Se le specie Listeria non sono state isolate con il conteggio, ma lo sono con la
procedura di arricchimento, refertare:
“Specie Listeria rilevate in 25 g (meno di 10/g)”
Refertare anche l’identificazione della specie. Se non è stata riscontrata L. monocytogenes,
refertare questa separatamente come descritto in precedenza.
Se sono confermate alcune colonie come Listeria monocytogenes, refertare come:
“Listeria monocytogenes rilevata in 25g (meno di 10/g)”
Se le specie Listeria, compresa L. monocytogenes, sono state rilevate con il conteggio, refertare il
numero totale come specie Listeria come conta per grammo o mL. Refertare separatamente anche
il conteggio di L. monocytogenes per g o mL.
Se il numero del microrganismi ricercato è compreso fra 10 e 99 per grammo, refertare nel modo
seguente:
a ufc/g
ove a è un numero compreso fra 10 e 99
Se i microrganismi ricercati sono rilevati a conteggi superiori od uguali a 100 per grammo, refertare
con una cifra precedente ed una successiva al punto decimale espresso dalla potenza di 10
secondo la formula;
a x 10b ufc/g
ove a non è mai inferiore a 1.0 o superiore a 9.9 e b rappresenta l’appropriata potenza di dieci.
Arrotondare i conteggi al numero superiore se l’ultima cifra è 5 o maggiore ed a quello inferiore se
l’ultima cifra è 4 od inferiore:
esempio: 1920 ufc/g è refertato come 1.9 x 103 ufc/g
235.000/g è refertato come 2.4 x 105 ufc/g
Deve essere riportato il peso reale dell’alimento esaminato, per esempio 10 g, 25 g, 100 g.
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STRUTTURE DI RIFERIMENTO
Tutti gli isolati di L. monocytogenes (emolitici e non emolitici), indipendentemente dalla loro
concentrazione, devono essere inviati per la conferma a la caratterizzazione successiva al Food Safety
Reference Unit, Laboratory, of Gastrointestinal Pathogens, HPA Centre for Infections .
Accedere al collegamento riportato per ottenere un modulo di richiesta per l’invio alle strutture di
riferimento
http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=1158313
434370
Centro per le Infezioni: tel: 0208 327 7116 o 028 327 6505
10 RINGRAZIAMENTI ED CONTATTI
Questi Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati e controllati dal Food and Dairy
Working Group for National Standard Methods (http://www.hpastandardmethods.org.uk/wg_food_dairy_
group.asp). Si ringraziano per il contributo le numerose persone appartenenti a laboratori per Alimenti,
Acqua, Ambiente, i laboratori di riferimento e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito
informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed infine il Redattore
Medico.
I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Department for Evaluations, Standards
and Training, Centre for Infections, Health Protection Agency London.
Per ulteriori informazioni contattateci a:
Standards Unit
Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
Health Protection Agency
Colindale, London
NW9 5EQ
e-mail [email protected]
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APPENDICE 1: DIAGRAMMA DI FLUSSO PER PROCEDURA
DI RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES
E DI ALTRE SPECIE LISTERIA
Ricerca
Arricchimento primario
Alimenti e prodotti lattiero caseari
Pesare o misurare 25 g o mL di campione ed aggiungere 225 mL di brodo di Fraser a mezza concentrazione
Tamponi ambientali
Immergere in brodo di Fraser a mezza concentrazione (rapporto circa 1:9)
Omogeneizzare con stomacher o passare su vortex
Incubare a 30°C r 1°C per 24 r 2 ore
Eseguire sottocolture in agar selettivi e confermare gli isolati come di seguito descritto per l’arricchimento secondario
Arricchimento secondario
Seminare 0.1 mL di brodo incubato di Fraser a mezza concentrazione in 10 mL di brodo di Fraser
Incubare a 37°C per 48 ore
Eseguire sottocolture in agar selettivi
Incubare le piastre di agar Listeria cromogenico e di oxford a 37°C r 1°C per 48 ore in condizioni aerobiche
Esaminare a 24 r 3 ore e di nuovo dopo altre 24 r 3 se necessario
Eseguire sottocolture di 5 colonie sospette su agar sangue di cavallo
Incubare a 37°C r 1°C per 24 r 3 ore
Selezionare per la conferma appropriati tipi morfologici di colonie
Identificare come specie Listeria o Listeria monocytogenes con il sistema API di identificazione per Listeria
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Conteggio
Preparare una diluizione10-1 del campione
Omogeneizzare con stomacher (alimento, tamponi) o miscelare su vortex (tamponi)
Preparare diluizioni successive in diluente peptone salino
Diffondere 0.5 mL della diluizione 10-1 sulla superficie di due piastre di Listeria cromogenico
Se è atteso un conteggio elevato, seminare anche 50 µL delle diluizioni10-1 e 10-3
su agar Listeria cromogenico utilizzando un distributore a spirale
Incubare le piastre di agar Listeria cromogenico a 37°C r 1 C° per 48 ore in condizioni aerobiche
Esaminare a 24 r 3 ore e dopo altre 24 r 3 ore
Eseguire sottocoltura di 5 colonie sospette su agar sangue cavallo
Incubare a 37°C r 1 C° per 24 r 3 ore
Identificare utilizzando sistema identificazione API Listeria
Calcolare il numero di Listeria spp. (e L. monocytogenes se presente) per grammo o mL
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APPENDICE 2: CONFRONTO FRA METODO HPA F 19 ED ISO
11290 PARTI 1 E 2
Metodo HPA F19
ISO 11290 parti 1 e 2
Solo definizione di
Listeria monocytogenes
Definizione
Include la definizione di specie
Listeria
Tamponi
ambientali
Descrive la procedura per i tamponi
ambientali
Applicabile solo a prodotti preparati per
consumo umano o alimenti per animali
Indica il volume delle sospensione
iniziale da semiasse sull’agar
per il conteggio nella quantità di
0,5 mL per piastra da 90 mm
Indica il volume delle sospensione
iniziale da semiasse sull’agar
per il conteggio nella quantità di
0,1 mL (o 1 mL per tre piastre
da 140 mm).
Fase di rivitalizzazione non inclusa
Descritta fase di rivitalizzazione
Sistema
identificazione
API
Descrive l’uso del sistema di
identificazione API
ISO precisano le fasi d’identificazione
Laboratorio di
Riferimento
Tutti gli isolati di L. monocytogenes
devono essere inviati per conferma
Tutti li isolati possono essere inviati per
conferma
Volume
Rivitalizzazione
dei microrganismi
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BIBLIORAFIA
1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December 1997.
2. Commission Regulation (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 (and as amended) on
microbiological criteria for foodstuffs. Official Journal of the European Union; 2005. p. L338 1-26
3. The Food Hygiene (England) (No 14) Regulations 2006 Statutory Instrument. England: HMSO;
2006.
4. Gilbert RJ, de Louvois J, Donovan T, Little C, Nye K, Ribeiro CD, et al. Guidelines for the
microbiological quality of some ready-to-eat foods sampled at the point of sale. PHLS Advisory
Committee for Food and Dairy Products. Commun Dis Public Health 2000;3:163-7.
5. BS EN ISO 11290: 1997 incorporating Amendment No. 1: 2004. Microbiological examination of
food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Listeria
monocytogenes - Part 1 (BS 5763, Part 18 - 1997): Detection method. London: British Standards
Institution (BSI); 1997.
6. BS EN ISO 11290: 1998 incorporating Amendment No. 1: 2004. Microbiological examination of
food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Listeria
monocytogenes - Part 2: Enumeration method. London: British Standards Institution (BSI); 1998.
7. Greenwood M, Willis C, Doswell P, Allen G, Pathak K. Evaluation of chromogenic media for the
detection of Listeria species in food. J Appl Microbiol 2005;99:1340-5.
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detection of Listeria in food. J Appl Microbiol 2006;101:711-7.
9. Beumer R, Hazeleger W. Chromogenic media for the detection and/or enumeration of Listeria
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10. Control of Substances Hazardous to Health Regulations 2002. General COSHH. Approved Code
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11. Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service Laboratories. Safe working and the
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12. Advisory Committee on Dangerous Pathogens Infection risks to new and expectant mothers in the
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13. Curtis G, Mitchell R, King A. A selective differential medium for the isolation of Listeria
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14. National Standard Method QSOP 49 - Safe use of plastic bags for incubation of food samples.
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15. Leclercq A. Atypical colonial morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on
Oxford, PALCAM, Rapid'L.mono and ALOA solid media. J Microbiol Methods 2004;57:251-8.
16. Roberts D, Greenwood M H, editors. Practical Food Microbiology. 3rd ed. Oxford: Blackwells;
2003.
17. McLauchlin J. The identification of Listeria species. Int J Food Microbiol 1997;38:77-81
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