UPDATE MALATTIA CELIACA
SIEROLOGIA DELLA MALATTIA CELIACA
UNITA’ DI PATOLOGIA CLINICA
AZIENDA OSPEDALI RIUNITI VILLA SOFIA-CERVELLO
Direttore Dott: Tomaso Stampone
Negli anni passati questa malattia veniva sospettata solo nei bambini che non crescevano.
Negli ultimi anni, l’epidemia della celiachia ha assunto dimensioni inaspettate a livello
globale, ed in molti paesi occidentali da malattia rara è divenuta una condizione molto
diffusa, con un elevato impatto sociale essendo una malattia che dura tutta la vita se non
si inizia una dieta priva di glutine.
Recentemente si è visto che la M.C. in realtà è molto diffusa e subdola e può comparire in un periodo
qualsiasi della vita con sintomi molto sfumati
Nell’età adulta è caratterizzata dalla presenza di una combinazione variabile di
manifestazioni cliniche associate o no ai sintomi gastro-intestinali Oggi si può
affermare che i celiaci con il classico quadro di malassorbimento intestinale,
caratterizzato da diarrea e perdita di peso, sono sempre più rari ad osservarsi, mentre
predominano altri sintomi la stipsi ostinata, i dolori addominali, l’anemia sideropenica e
l’osteoporosi.
E’ una malattia cronica sistemica
immunomediata indotta dall’ingestione di
glutine che, in soggetti geneticamente
suscettibili, determina un processo
infiammatorio che porta a lesioni della mucosa
dell’intestino tenue con conseguente
malassorbimento e manifestazioni
extraintestinali
Glutine
ingerito
Genetica
HLA II
DQ2/DQ8
Antigliadina
( Ag esogeno )
Fattori di rischio
(Sesso allattamento
infezioni altro )
Anti transglutaminasi
( Ag endogeno)
Anti endomisio
( Ag endogeno )
Malattia celiaca
sistema nervoso
cuore
cute e cavità orale
fegato
sistema emopoiteco
Organo
bersaglio
intestino
tenue
osso
sistema riproduttivo
femminile e maschile
tiroide
La celiachia è una malattia per cui l'ingestione di
glutine (in particolare della proteina gliadina)
determina un aumento della permeabilità
epiteliale e contemporaneamente un’attivazione
della transglutaminasi tissutale che ha un ruolo
importante nell’innescare il disordine
immunologico attraverso la deamidazione della
gliadina che viene trasformata in peptidi ricchi di
acido glutammico ad alta affinità per la tasca
recettoriale HLA DQ2/DQ8 situate sulla superficie
delle APC.
Questi peptidi vengono processati dalle APC ed
esposti sulla loro superficie stimolano i linfociti T
CD4+ ( che una volta attivati iniziano a produrre
citochine ) e i linfociti B ( produzione di anticorpi
AGA, anti-tTG ed EMA )
MARCATORI SIEROLOGICI
A partire dagli anni 80,grazie alla
individuazione della patogenesi e la
comparsa dei primi marcatori sierologici, il
laboratorio
è diventato componente fondamentale del
percorso diagnostico della malattia celiaca
Si tratta di analisi di laboratorio che
prevedono un normale prelievo di sangue
e che non richiedono alcuna specifica
preparazione.
Gli anticorpi appartengono alla classe IgA ed IgG, ma in generale solamente gli
anticorpi di classe IgA possono essere considerati marker altamente sensibili e specifici
per l’intolleranza al glutine.
L’impiego dei marker di classe IgG e spesso fuorviante a causa dell’elevata percentuale
di falsi positivi ed il loro uso dovrebbe essere limitato ai pazienti con deficit di IgA. ,
condizione strettamente associata alla celiachia.
IgA che corrispondono al 20% delle immunoglobuline circolanti (immunità locale)
IgA DEFICIENCY
IgA…….
IgM…..
IgG……
IgA n.d. (alla nascita)
70-370 mg/dl (normal range)
60-260 mg/dl
700-1600 mg/dl
8-74( 3 mesi)
10-85 (1 anno)
60-270 (2-10 anni)
Si osservano, molto spesso deficit parziali, ossia casi in cui la produzione anticorpale esiste,
ma è in quantità insufficiente per l’età.
SEROLOGICAL TESTS
Tissue transglutaminase antibody (IgA-IgG)
Endomysial antibody (IgA-IgG)
Antibodies against deamidated gliadin (IgA-IgG)
ANTICORPI ANTIGLIADINA- AGA
Sono i primi anticorpi messi in
evidenza nei soggetti con CD: sono
Ab diretti contro un Ag esogeno, la
alfa gliadina da glutine di grano. Nel
siero dei soggetti con CD si trovano
Ab AGA isotipi IgA e IgG. La
determinazione delle IgA è utile nella
diagnosi delle malattia in fase attiva e
nel monitoraggio del comportamento
alimentare dopo prescrizione della
dieta priva di glutine.


ANTIGLIADINA AGA IgA IgG
(1967- 1970) (Dike 1950)
ELISA
Un tempo esame di elezione per la
diagnosi di celiachia
risultano positivi anche in altre
patologie
BASSA SENSIBILITA’ 70-90% E
SPECIFICITA’ 82-92%
METODICA ELISA
Valori di riferimento
Negativo
Deb.positivo
Positivo
Unità
<20
20-30
>30
Limiti della metodica legati alla scarsa specificità (rischio di falsi positivi)
LA TRANSGLUTAMINASI TISSUTALE (tTG)
Caratteristiche:
 Enzima ubiquitario Ca++dip.
 Amino-γ-glutamil-transferasi Peso molecolare: 78,24 k
 Catena aminoacidica: 689 aa Assenza di ponti di-solfuro
 Esistono diverse forme isoenzimatiche: Transglutaminasi 2 presente a livello
della lamina propria dell’intestino tenue nei celiaci
ANTITRANSGLUTAMINASI tTG IgA/ IgG
(1997 W. Dieterick)
E’ stata identificata come l'antigene più importante nella malattia celiaca. Gli anticorpi IgA
anti-tTG sono dei marcatori sierologici altamente specifici per la malattia celiaca . Gli
anticorpi IgG anti-tTG sono meno specifici, ma sono comunque un valido marker nei
pazienti con deficit di IgA.
METODICA :
ELISA
automatica
risultati affidabili precisi quantitativi
Valori di riferimento:
Unità
Negativo
Deb.positivo
Positivo
<20
20-30
>30
TRANSGLUTAMINASITISSUTALE
FONTI DI ANTIGENE
Fonti naturali
Tecniche ricombinanti
Purificato da fegato
Procarioti(E. Coli)
di guinea pig
Baculovirus /
cellule eucariote di insetto
Estratto da eritrociti
umani
293-EBNA cellule renali embrionali
Coltura di cellule d'insetto Spodoptera frugiperda (Sf9) infettate con
baculovirus ricombinante a 48 ore dall'infezione
I baculovirus sono una famiglia di virus in grado di infettare una grande varietà
di artropodi ed in particolar modo le larve di Spodoptera frugiperda (Sf9)
assumono un’importanza fondamentale nella pratica di laboratorio così come
nell’industria, in quanto attraverso opportune modificazioni genetiche del loro
genoma (baculovirus ricombinante) è possibile impiegarli come vettori di
espressione per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti.
Figura 1
Profilo elettroforetico della tTG ottenuto con diverse tecnologie di produzione (Gelfiltrazione con 0.3 mg/ml di preparato proteico). La transglutaminasi ottenuta con la
tecnologia DNA ricombinante eucariota Baculovirus/cellule di insetto presenta un profilo
elettroforetico tipico di una proteina omogenea, in forma integra e priva di
contaminazioni. La proteina ottenuta con le altre tecnologie di produzione presentano
invece limiti o di integrità e/o di purezza.
Detection of endomysial antibodies
MONKEY EOSOPHAGUS ENDOMYSIAL
Anticorpi Anti-Endomisio su esofago distale di scimmia
ANTICORPI ANTI ENDOMISIO
EMA
ANTIENDOMISIO EMA
(1983 Chorzelski)
IFA
Sono autoanticorpi diretti verso l’endomisio della muscolatura liscia dell’intestino.
Il test degli anticorpi anti-endomisio, effettuato con la metodica
dell’immunofluorescenza indiretta che utilizza come substrato antigenico l’esofago
distale di scimmia o il cordone ombelicale umano e che rende visibile la reazione
ANTIGENE-ANTICORPO marcando con la fluorescina o la rodamina.
Al microscopio la positività degli EMA appre come una intensa fluorescenza a nido
d’ape
Viene attualmente utilizzato dalla maggior parte
dei laboratori come test di conferma per i
casi positivi per gli anti-tTG
EMA
Elementi critici della procedura
Interpretazione soggettiva
Utilizzo di substrati ottenuti da due particolari linee
cellulari
Metodica semiquantitativa
ANTI-tTG
EMA
DGP-AGA
Sono un nuovo interessante marcatore, avente una specificità talmente elevata (99%) un
Valore Predittivo Positivo molto elevato da raggiungere quella degli EmA IgA e quella degli
anti-tTG IgA
I DGP-AGA, inoltre, si sono rivelati anche ottimi marcatori immunologici per individuare
celiaci al di sotto dei due anni di età infatti sono rilevabili ancora prima rispetto alle IgA tTG.
Deamidated gliadin
peptide
Nel primo tratto intestinale, ad opera dell’enzima transglutaminasi tissutale (tTG), la gliadina viene
deaminata e trasformata in peptidi ricchi di acido glutammico ad alta affinità per la tasca
dell’eterodimero DQ2. il legame tra i peptidi della gliadina deamidati e le APC è responsabile
della risposta autoimmunitaria.
O
H2N
NH2
O-
O
C
C
CH2
CH2
CH2
CH2
C
C
COOH
H
Gln
H2N
H
Glu
COOH
Le cariche negative introdotte da questo processo di deamidazione aumentano l’affinità dei peptidi con la molecola DQ2.
L’enzima transglutaminasi tissutale (tTG) a livello della mucosa intestinale attraverso un processo di deaminazione converte la glutammina ad acido
glutammico. * Range di normalità <8 U/ml; zona cut-off (or zona intermedia) 5-8 U/ml
Gliadina Deamidata (DGP)


L’anticorpo di classe IgG (IgG DGP) è la vera
novità In aggiunta alle tTG aumenta la nostra
capacità diagnostica
IgG DGP:
–
–
–
–
Può essere impiegato nei deficit di IgA sia nei bambini
che negli adulti unico esame utile da richiedere
Può essere impiegato nei bambini al di sotto dei due anni
di età come test aggiuntivo
Il test Gliadina Deamidata IgG consente il recupero
significativo dei cosiddetti “falsi positivi
IgG DGP è un marcatore più tempestivo della aderenza
alla dieta aglutinata in quanto gli anti tTg e gli EMA si
negativizzano in ritardo
Lewis&Scott. Deamidated gliadin and tTG compared as screening for
coeliac disease. Aliment Pharmacol 2010
IgA – DGP

IgA - tTG
Sono anche disponibili test rapidi,
eseguiti su goccia di sangue, per
la ricerca
degli anti-tTG. L’accuratezza
diagnostica dei test
rapidi è indubbiamente inferiore a
quella dei
marker sierologici tradizionali, per
cui il risultato
di questi test dovrebbe essere
sempre controllato
con la ricerca degli anti-tTG in
ELISA. Si tratta di un test
qualitativo (anticorpi sì - anticorpi
no )
ALGORITMO DIAGNOSTICO
Quali anticorpi devono essere utilizzati nello screening della
celiachia?
Un’altra importante pietra miliare nella storia della
celiachia!
CONGRESSO ESPGHAN 2011: 25-27 maggio 2011, Sorrento
 Da diversi anni un gruppo
dell’ESPGHAN sta lavorando alla
formulazione di più attuali criteri
diagnostici, la cui validazione clinica
dovrebbe concludersi a breve con la
pubblicazione delle nuove linee
guida. In accordo a tali criteri, la
diagnosi di celiachia dovrà realizzarsi
attraverso l’integrazione di dati
clinici, sierologici, genetici, istologici,
definire nuovi percorsi diagnostici
più appropriati e richieste di esami
più mirate
In presenza del sospetto clinico di celiachia (soggetto con manifestazioni tipiche ed
atipiche), si procederà al dosaggio delle IgA totali e alla ricerca degli anticorpi antitransglutaminasi. Sulla base del valore delle transglutaminasi, è possibile distinguere 3
scenari clinici
SCENARIO CLINICO 1: in caso di forte positività degli anti-transglutaminasi (valori superiori a 10 volte i
valori massimi di riferimento) in soggetti sintomatici, per confermare la diagnosi di celiachia sarà
sufficiente riscontrare gli anti-endomisio e, mediante il test di tipizzazione genetica, un HLA compatibile
(DQ2 o DQ8); in caso di negatività degli anti-endomisio e del test genetico, si dovrà riconsiderare la
diagnosi; in caso di discordanza tra il risultato degli anti-endomisio e del test genetico, la biopsia
intestinale sarà comunque necessaria.
SCENARIO CLINICO 2: in caso di anti-transglutaminasi presenti a basso titolo (<10 volte
rispetto al limite massimo dei valori di riferimento), i soggetti sintomatici dovranno
comunque essere sottoposti all’esame endoscopico con biopsia intestinale per confermare il
sospetto diagnostico.
SCENARIO CLINICO 3: in caso di negatività degli anticorpi anti-transglutaminasi, la diagnosi di celiachia viene
verosimilmente esclusa. In presenza di sintomatologia clinica molto suggestiva, il sospetto tuttavia rimane se: 1)
c’è un contestuale deficit delle immunoglobuline della classe IgA – sempre da dosare insieme agli antitransglutaminasi in prima battuta-; 2) i soggetti sono bambini con <2 anni d’età; 3) c’è stata una scarsa
assunzione di glutine nel periodo precedente l’esame; 4) sono stati assunti farmaci ad attività immunosoppressivi.
Il futuro
 Standardizzazione dei test sierologici per potere eseguire uno
screening di massa in bambini in età prescolare
 Diminuire il numero delle diagnosi basata sulla biopisia verso un
approccio combinato che valorizza sempre di più la sierologia e la
genetica La biopsia non scompare . Resta fondamentale nei casi
non conclamati
 Necessità di un periodo per l’implementazione e la validazione
delle linee guida che definiscano percorsi diagnostici più
appropriati e condivisi nell’interesse e beneficio del paziente
 Realizzare un referto di laboratorio dove includere un commento
esplicativo ed eventualmente la prescrizione degli esami
necessari per il completamento dell’iter diagnostico
Grazie per l’attenzione