AUTOMAZIONE DEI PERCORSI
DIAGNOSTICI PER LA DIAGNOSI DI
LABORATORIO DELLA MALATTIA CELIACA
E. Tonutti (Udine)
Flow
Flowchart
chartfor
forthe
thediagnosis
diagnosisof
ofceliac
celiacdisease
disease
tTG IgA + total IgA
tTG IgA positive
EMA IgA
tTG negative
non IgA deficiency
STOP
tTG IgA negative <5 yrs
Total IgA deficiency
AGA IgA and IgG
tTG and AGA IgG
positive
negative
biopsy
STOP
negative
positive
negative
haplotype
biopsy
STOP
positive
haplotype
negative
positive
negative
positive
control
biopsy
STOP
biopsy
Perché le IgA totali?
I soggetti con deficit di IgA hanno un rischio
relativo di sviluppare celiachia 10 volte
superiore alla popolazione normale.
Per ciascuna richiesta di a-tTG o EMA
dobbiamo escludere il deficit.
Su tutti i sieri eseguire il dosaggio delle IgA
totali o…….
IgA totali
Individual IgA anti-tTG
absorbance values
according to the
serum total IgA
concentration
IgA totali
Individuato il deficit di IgA
anti-tTG IgG e AGA IgG
Anticorpi anti-gliadina (AGA)
• La ricerca per AGA deve essere eseguita
utilizzando i nuovi test con peptidi deamidati della
gliadina (non devono più essere utilizzati i test con
gliadina estrattiva)
• Gli AGA peptidi IgG presentano una elevata
specificità e devono essere utilizzati assieme agli
a-tTG IgG per la diagnosi nei deficit di IgA
• Gli AGA peptidi IgA e IgG hanno un ruolo
diagnostico in età pediatrica ed in tutti i casi nei
quali a-tTG ed EMA non sono dirimenti o
concordanti
Authors
Method
Sugai et al Clin
Gastr Hepat 2006
CD 92 Adults
Inova
Agardh et al. Clin
Gastr Hepat 2007
CD 119 Children
Inova
Niveloni et al. Clin
Chem 2007
CD 60 Adults
Inova
Ankelo et al Clin
Exp Immunol
2007
CD 87 Ad. & Chil.
Homemade
Volta et al, Dig
Dis Sci 2007.
CD 128 Adults
Inova
Korponay-Szabo
et al. IPGN 2008
CD 74 Ad & Chil.
Inova
Prause et al 2007
CD Children 137
GAF(3x)
Euroim
IgA-DGP
IgG-DGP
IgA-AGA
IgG-AGA
SE
SP
SE
SP
SE
SP
SE
94.6
99.1
92.4
100
76.1
94.7
91
H 91
P 92
95
98.3
93.8
92
SE
SP
96.
7
92.8
H 86
P 99
97
H 96
P 98
96.7
100
95
97.5
90
75
98
87
72
78
64
96.7
92.8
83.6
90.3
84.4
98.5
72.6
86.6
73.4
76.9
96.8
91
100
98.5
100
98.5
85.4
94.8
94.9
97.4
94.2
95.7
75.9
88.7
87.6
SP
IgA-tTG
77.4
IgG-tTG
SE
SP
13
100
86.9
86.1
16 pazienti con deficit di IgA e
diagnosi istologica di celiachia
GAF IgG = 93.7%
GLIADINA IgG = 68.7%
a-tTG IgG = 87.5%
Percorso diagnostico di laboratorio:
1)Test a-tTG IgA su strumento dedicato
2)Dosaggio delle IgA totali con strumento dedicato
su tutti i campioni o su quelli selezionati dopo
valutazione dei risultati del test a-tTG IgA
3)Se deficit di IgA è necessario rianalizzare il siero
per a-tTG IgG e AGA IgG (test con peptidi)
RISULTATO: Più prelievi - TAT lungo - iter
complesso
Nuovo strumento in grado di
automatizzare il percorso diagnostico
della malattia celiaca:
Strumento: IDS ISYS (Immuno Diagnostic Systems)
Kit diagnostici per autoimmunità: BoutyTechnogenetics (Progetto CLARA)
Processatore random access
Sistema analitico: particelle magnetiche adsorbite
con antigene specifico
Sistema di rilevazione del segnale;
chemiluminescenza (estere di acridinio)
IDS-iSYS system
Sono stati sviluppati i seguenti test
diagnostici per celiachia:
-Kit per anti-transglutaminasi IgA (antigene
ricombinante umano) con possibilità di
individuare sieri con deficit di IgA
-Kit per anti-transglutaminasi IgG (antigene
ricombinante umano)
-Kit per anticorpi anti-peptidi deamidati della
gliadina IgA e IgG
Il test per la determinazione delle IgA
totali e degli anticorpi antitransglutaminasi IgA è il core
diagnostico del processo
Una fase solida costituita da microparticelle
sensibilizzate con l’antigene transglutaminasi addizionate
con microparticelle sensibilizzate con anticorpi
monoclonali anti-IgA umane.
Nella seconda fase di reazione si utilizza un tracciante
costituito da anticorpi monoclonali anti-IgA umane
marcati.
Nei campioni non contenenti anticorpi IgA anti-tTransglutaminasi la risposta varia esclusivamente in
funzione della concentrazione di IgA totali presenti nel
campione.
Per eliminare la possibile misclassificazione dei
campioni a causa della risposta aggiuntiva generata
dalla concentrazione di IgA, la quantità di
microparticelle anti-IgA aggiunte nel sistema di
reazione è stata studiata in modo da fornire una
curva di calibrazione sensibile in presenza di basse
concentrazioni di IgA ma “a saturazione” in
presenza di normali o alte concentrazioni di IgA
totali.
Per la normalizzazione delle risposte ottenute e per
la loro interpretazione è stata elaborata una curva
standard in grado di raccordare le risposte ottenute
con ambedue le microparticelle.
ANTI t-TRANSGLUTAMINASE IgA CLARA
Total IgA and anti-tTG IgA Standard Curves
80000
70000
10 UA/mL
Cut off a-tTG IgA
60000
6.5 UA/mL
RLU
50000
40000
200 mg/dL IgA
2.9 UA/mL
30000
20000
25 mg/dL IgA
Cut off IgA: se <17000
RLU scatta il test reflex
per a-tTG IgG e AGA IgG
10000
0 mg/dL IgA
0
0.01
0.1
1
UA/mL
10
100
ANTI t-TRANSGLUTAMINASE IgA CLARA
Negative Samples
80000
70000
60000
RLU
50000
40000
30000
20000
10000
0
0.01
0.1
1
UA/mL
10
100
• Il percorso diagnostico su IDS ISYS
avviene in questo modo:
• I sieri vengono caricati sullo strumento; su ciascun siero
possono essere eseguiti uno o più parametri (es: nei
bambini < 5 anni: a-tTG IgA e AGA peptidi IgA e IgG)
• Il test per a-tTG IgA è strutturato in modo da “dosare”
anche le IgA totali
• La macchina fornisce i risultati e su tutti i test per a-tTG
IgA seleziona quelli con valori di RLU < ad una soglia
compatibile con deficit di IgA.
• Su questi sieri il software dello strumento fa eseguire i
test “reflex” a-tTG IgG e AGA peptidi IgG.
Studio per la valutazione del sistema
analitico, dei test e del sistema reflex:
40 sieri di soggetti con prima diagnosi di celiachia
15 sieri di soggetti con deficit di IgA (6 celiaci)
29 sieri di soggetti celiaci in dieta (3-35 mesi)
60 soggetti non celiaci
• Su tutti i sieri sono stati eseguiti i 4 test a-tTG IgA e
IgG e AGA peptidi IgA e IgG Clara per correlare i
risultati con a-tTG IgA e IgG Orgentec e AGA peptidi
IgA e IgG INOVA
•Simulazione di una seduta per la ricerca di a-tTG IgA
con sistema reflex per AGA IgG e a-tTG IgG sui sieri
con valori di IgA < 25 mg/dL.
A-tTG IgA
CLARA SYSTEM:
comparison with ELISA
400
350
UA/mL CLA
300
250
200
150
y = 1,9336x + 5,1948
R2 = 0,9487
100
50
0
0
50
100
U/mL ELISA
150
(Orgentec)
200
A-tTG IgG
CLARA SYSTEM:
comparison with ELISA
400
350
UA/mL CLA
300
250
200
150
100
y = 2,3747x - 11,16
R2 = 0,7239
50
0
0
20
40
60
80
U/mL ELISA
100
120
(Orgentec)
140
160
CLARA SYSTEM:
AGA peptidi IgA
comparison with ELISA
350
300
y = 1,1181x - 10,435
R2 = 0,88
UA/mL CLAR
250
200
150
100
50
0
0
50
100
150
U/mL ELISA
200
(INOVA)
250
AGA
CLARA SYSTEM:
comparison with ELISA
200
peptidi IgG
y = 0,8519x - 3,662
2
R = 0,7267
180
160
UA/mL CLAR
140
120
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
U/mL ELISA
100
120
(INOVA)
140
160
Celiaci
1a diagnosi
Celiaci in
dieta
Deficit di
IgA (6 cel.)
Controlli
n° 40
Sensibilità
n°29
Sensibilità
n°15
Sensibilità
n°60
Specificità
a-tTG IgA Clara
100%
79.9%
0%
100%
a-tTG IgA Orgentec
97.5%
51.7%
0%
100%
a-tTG IgG Clara
57.5%
27.5%
46.6%
100%
a-tTG IgG Orgentec
60%
13.8%
46.6%
100%
AGA IgA Clara
77.5%
20.7%
0%
100%
AGA IgA INOVA
77.5%
24.1%
0%
ND
AGA IgG Clara
70%
24.1%
40%
96.6%
AGA IgG INOVA
72.5%
31.3%
33.3%
ND
Concordanza
40 pazienti celiaci alla diagnosi
A-tTG IgG
A-tTG IgA
Orgentec +
Orgentec -
Orgentec +
Orgentec -
Clara +
39
1
Clara +
19
4
Clara -
0
0
Clara -
5
12
AGA IgA
INOVA +
AGA IgG
INOVA -
INOVA +
INOVA -
Clara +
29
2
Clara +
28
0
Clara -
2
7
Clara -
1
11
Concordanza
15 deficit di IgA (6 diagnosi di celiachia)
A-tTG IgG
A-tTG IgA
Orgentec +
Orgentec -
Orgentec +
Orgentec -
Clara +
0
0
Clara +
6
1
Clara -
0
15
Clara -
1
7
AGA IgA
INOVA +
AGA IgG
INOVA -
INOVA +
INOVA -
Clara +
0
0
Clara +
5
1
Clara -
0
15
Clara -
0
9
Concordanza
29 pazienti celiaci in dieta (3- 45 mesi)
A-tTG IgG
A-tTG IgA
Orgentec +
Orgentec -
Orgentec +
Orgentec -
Clara +
14
9
Clara +
3
5
Clara -
1
5
Clara -
1
20
AGA IgA
INOVA +
AGA IgG
INOVA -
INOVA +
INOVA -
Clara +
5
1
Clara +
6
1
Clara -
2
22
Clara -
3
20
La procedura di utilizzo dello strumento IDS
impostato con i test reflex (a-tTG IgG e AGA IgG) ha
dimostrato una corretta individuazione di tutti i 15
sieri con deficit di IgA e la conseguente esecuzione
dei test reflex.
Il valore in mg/dL di IgA “dosato” per ciascuno dei 15
sieri con deficit è stato il seguente:
N°
IgA mg/dL
657
2,2
662
8,0
722
2,4
726
2,1
829
16,0
084L
2,1
1324
1,5
136L
4,7
1398
1,6
1830
2,4
1831
4,8
1884
1,5
2162
3,0
2358
5,7
2867
2,7
CONCLUSIONI
• I kit diagnostici Technogenetics Clara per a-tTG e AGA
peptidi IgA e IgG forniscono ottime performance
diagnostiche.
• Lo strumento IDS Isys è in grado di fornire una
risposta di completa automazione al laboratorio di
autoimmunologia
• L’algoritmo sviluppato su IDS Isys è in grado di
coprire l’iter diagnostico della malattia celiaca
riducendo costi e tempi di refertazione
• L’efficienza del sistema IDS può portare ad una
migliore qualità diagnostica per l’inquadramento della
celiachia