Università degli studi di Pavia
MESSA A PUNTO DELL’APPARATO OTTICO
DI UN SISTEMA COMPATTO PER
MICROSCOPIA OTTICA A DUE FOTONI
Elaborato di Laurea di ELENA UGOLOTTI
Relatore: Prof. A. Tomaselli
Correlatore: Prof C. Vacchi
Scopo del progetto
Sviluppare un sistema:
•
Che sfrutti la
microscopia a due fotoni
•
Possibilità di osservare
campioni biologici in vivo
•
Risoluzioni
submicrometriche
•
Economico
•
Compatto
Microscopia a due fotoni
Due fotoni simultanei nell’IR
stimolano lo stesso salto
energetico di un singolo
fotone nell’UV-VIS
Vantaggi:
• Processo non lineare:
fltot  I ( z ) 2  w( z ) 2 
1
w( z ) 2
L’intensità è concentrata solo nel
punto da osservare
• Non si generano radicali liberi
• Maggior penetrazione nel
campione
Schema del microscopio presente in
laboratorio:
Specchi di
deflessione
f=35mm
Divisore di fascio
f=85mm
Obiettivo
Campione
f=30mm
Laser
Fototubo
Microscopio presente in laboratorio
Scopo del mio lavoro:
Quando ho iniziato il lavoro, lo schema del
microscopio era provvisorio in quanto non era mai
stato fatto uno studio accurato e delle simulazioni
del sistema ottico.
Scopo del mio lavoro: studiare la configurazione
ottica ottimale per il sistema, che sia un buon
compromesso tra compattezza del dispositivo e
risoluzione ottenibile.
Fasci gaussiani
Parametri importanti:
Distanza di Rayleigh:
zr
w0 2


Raggio di curvatura:
z
R( z )  z  r
z
2
Raggio di curvatura complesso q(z):
1
1
2

i
q( z ) R( z )
kw( z ) 2
Raggio del fascio:
w( z )  w0
 z
1  
 zr



2
Metodo matriciale “ABCD”
La propagazione dei fasci Gaussiani
attraverso ottiche anche complesse può
essere studiata tramite le matrici ABCD:
Se ci sono più elementi ottici in
cascata la matrice totale del sistema
è il prodotto delle matrici dei singoli
elementi.
Con le matrici ABCD si ricava
direttamente:
Analisi del sistema:
Con il laser He-Ne si ha:
• λ = 632 nm
• w0 = 0,4 mm
f1 = 35 mm, f2 = 85 mm
θg = 0,08 rad
zr = 79 cm
wc = 1 μm
La zona di campione investigata
è un quadrato di lato 340 μm
La risoluzione che si ottiene non è sufficiente. Bisogna modificare le
distanze tra le ottiche o le focali delle lenti per migliorarla senza
diminuire l’area investigata.
Miglioramento della risoluzione
La risoluzione migliora quanto più le dimensioni del
fascio sul campione sono piccole
Il fascio deve incidere più ampio possibile
sull’obiettivo
Variabili che ho provato a modificare nel
sistema:
dS-L1
dL1-L2
dL2-O
f1
f2
Distanza specchi-prima lente:
Influisce sull’allontanamento del fascio dal centro
Bisogna assicurare l’ingresso di tutto il fascio nell’obiettivo e
l’ingresso sulle lenti in zone centrali non soggette a non idealità
Soluzione migliore:
Distanza pari alla focale della prima lente
Determina le dimensioni di campione esplorato durante
la scansione
Focale della prima e della seconda lente
del telescopio:
•
Entrambe le lenti del telescopio devono essere
convergenti
•
Ingrandimento M=f2/f1
•
Per le considerazioni fatte prima sulla distanza
specchi-prima lente e sugli ingombri, f1 non può
essere troppo piccola
f1 piccola, f2 grande
f1 = 35 mm ; f2 = 85 mm
Distanza tra le lenti:
•
Telescopio con lenti convergenti
•
Se d < f1 + f2
fascio uscente divergente
•
Se d > f1 + f2
fascio uscente convergente
d = f1 + f2
La convergenza non conviene: - si perde ingrandimento
- si peggiora compattezza
microscopio
La divergenza può essere vantaggiosa: - a pari compattezza
aumenta l’ingrandimento
- peggiorano le dimensioni
totali investigate
Per operare in divergenza: f2 = 150 mm
Distanza telescopio - obiettivo:
•
Indifferente se si opera in collimazione
Più piccola possibile per ridurre ingombro totale
del microscopio
•
Se si opera in divergenza:
distanza grande
migliore risoluzione,
ingrandimento maggiore,
zona esplorata più piccola
IDEA: Doppio telescopio
Ho pensato di aggiungere un secondo telescopio
prima degli specchi di deflessione per ingrandire
ulteriormente il fascio
 Significativo miglioramento della risoluzione
 Aumento delle dimensioni del microscopio

Perdita di potenza sulle lenti
Schema finale del
microscopio:
Lente
Lente,
f=30mm f=85-150mm
Obiettivo 40x
Galvospecchi
Lente
f=35mm
Campione
Fototubo
Beam-splitter
specchio
Lente
f=75mm
Lente
f=40mm
Immagini di un campione graduato prima
delle modifiche
50 μm
Ingrandimento 1x
Ingrandimento 4x
Immagini del campione graduato ottenute
con il doppio telescopio e in collimazione
(f2=85mm):
50 μm
Ingrandimento 1x
Ingrandimento 4x
Immagini del campione graduato ottenute con
il doppio telescopio e in divergenza
(f2=150mm):
Ingrandimento 1x
Ingrandimento 4x
Immagini di circuiti microelettronici (1):
Immagini di circuiti microelettronici (2):
2 μm
Immagini dei globuli rossi:
7 μm
Ingrandimenti 1x e 4x; diametro globuli di circa 7 μm
Immagini sferette di diametro 2,5 μm :
In collimazione (f2=85mm)
In divergenza (f2=150mm)
Caratterizzazione della profondità di fori
su silicio per BrightSolutions:
8 campioni di silicio con fori per
aumentare la superficie
illuminata di celle solari
Campioni diversi hanno fori di
profondità diversa perché
eseguiti con laser a potenza
diversa
Misurare la profondità dei fori
contando quanti passi
intercorrono tra il punto in
cui è a fuoco la superficie o
il fondo del foro
Futuri miglioramenti previsti (1):
Meccanica:
•
Visualizzare un campione posto in orizzontale
•
Creare un supporto fisso definitivo
Software:
•
Sviluppare un software per poter ricostruire
immagini in 3D
Futuri miglioramenti previsti (2):
•
Replicare una sorgente impulsata per il microscopio
Possibili sorgenti:
• Cr: Forsterite
λe=1240; λp=1064; Δimp=20-100fs
frip=60-150MHz
• Cr: LISAF
λe=860; λp=670; Δimp=20-100fs
frip=80-150MHz
• Nd: Glass
λe=1054; λp=804; Δimp=300fs
frip=140MHz
•
Sostituire il Beam-Splitter con un Cold Mirror