RNA interference e sue
applicazioni
 Cosa è l’RNA interference
 Come funziona
 Funzione biologica nei diversi organismi
 Come può essere utilizzata per fini applicativi e
di genetica funzionale
Che cosa è l’ RNA interference?
•L’RNA interference (RNAi o shRNA) è un fenomeno di silenziamento
post-trascrizionale dell’espressione genica (PTGS) -> Knockdown
dell’mRNA
• E’ basato sull’ attivazione del processo di degradazione dell’RNA
citoplasmatico sequenza- specifico
• Meccanismo di silenziamento genico presente ed applicabile in
protozoi, nematodi, Drosophila, piante, funghi e mammiferi
• I ruoli biologici dell’RNAi sono molteplici: difesa da virus patogeni ad
RNA, da elementi genetici mobili come trasposoni, regolazione
dell’espressione genica endogena, modulatore dei processi di
sviluppo embrionale, azione sul patrimonio genico
Annullamento della funzione di un gene
Knock out
Eliminazione del gene
Mediante inattivazione
genica specifica (ad es.
iniezione del gene
interrotto nell’oocita
fecondato o nelle ES)
Knock down
Eliminazione dell’mRNA
del gene
Mediante RNA
antisenso,
oligodeossinucleotidi,
ribozimi, o RNAi
Precedentemente si era osservato nelle piante ……
• Richard Jorgensen, nel 1990, nel tentativo di up-regolare la
pigmentazione di petunie transgeniche, ha introdotto il transgene della
calcone sintasi (chsA), enzima implicato nella produzione delle antocianine
cosoppressione
?
La perdita di chsA mRNA citosolico non era associata ad una ridotta
trascrizione ma l’espressione del transgene portava alla formazione di
dsRNA a causa di sequenze ripetute
……poi in altri organismi
• sono in grado di rispondere all’infezione da RNA virali
portando il genoma virale alla degradazione
meccanismo di difesa
• Meccanismi analoghi si ritrovano anche in Neurospora,
nei metazoi come Drosophila, C.elegans e nei mammiferi
Piante
C. elegans
Cellule
HeLa
Drosophila
Quelling in Neurospora crassa
In Neurospora crassa l’introduzione del transgene causa il
silenziamento del gene omologo endogeno albino-1 (al-1) codificante
una proteina del pathway biosintetico dei carotenoidi
Romano e Macino
(1992)
Cogoni et al., (1996)
wt
al-1 mutante
wt + transgene al-1
Il transgene causa la soppressione sia del gene endogeno che
esogeno
Modelli di studio dell’ RNAi
- studi genetici in C. elegans e in piante
- studi biochimici in estratti di Drosophila
L’RNAi avviene in tutti gli organismi con meccanismi
di base comuni che poi si specializzano a seconda
del tipo di funzione biologica
Evidenze in Drosophila in vitro e in vivo
-Estratti embrionali di Drosophila (cellule S2)
- Iniezione di dsRNA in cellule S2
a
+
AAAA
AAAA
AAAA
mRNA luciferasi
luciferasi
b
+
AAAA
AAAA
AAAA
+
dsRNA > 500
nucleotidi
Prima fase:
processamento del dsRNA in frammenti di 21-23 nt
• dsRNA (>500 nucleotidi)
incubato con lisati di embrioni
di Drosophila viene processato
a specie di 21-23 nucleotidi
• Il processo richiede ATP
• dsRNA diretto contro
sequenze introniche sono
inefficienti per il silenziamento
34
27
21
20
16
siRNA
• CHI PROCESSA dsRNA?
Zamore et al., (2001)
Gli siRNA hanno una struttura definita
19 nt duplex
Filamento senso
POH-
-P
Filamento antisenso
2 nt 3’’ overhangs
siRNA hanno la stessa struttura dei prodotti di
digestione della RNA-asi III di E.coli
-OH
Fase I: processamento del dsRNA in frammenti di 21-23
-Isolato in estratti di
embrioni di Drosophila
Dicer
short-interfering RNA
- Interferenza con la
funzione di Dicer riduce la
capacita’ di silenziamento
genico
- Il mutante DCR-1in
C.elegans produce un
omologo di Dicer ed e’
incapace di effettuare il
silenziamento genico
Dicer contiene 4 distinti domini
DCR-1 (C. elegans)
CAF/SIN-1(Arabidopsis thaliana)
“Dicer” e “Drosha” in mammals and Drosophila
Organismi mutanti per Dicer hanno difetti nello sviluppo
- RNA elicasi N-t ATP dipendente
- 2 domini RNA-asi III
- dsRNA binding domain c-t
- dominio PAZ (Piwi,Argo,Zwille/Pinhead che condivide con
proteine RDE1/QDE2/Argonaute, associate al processo di
inteference)
- Funziona come enzima dimerico
Fase II: il complesso
RISC
Taglio
endonucleolitico
nella regione di
omologia tra
RNAi e mRNA,
nel mezzo della
regione duplex
Il prodotto di Dicer RNAi
viene rilasciato ed
incorporato nel complesso
RISC, complesso RNA
nucleasico-proteico che
degrada l’mRNA target
Riepilogo del meccanismo
(21-23 nt)
Solo uno dei 2 filamenti
di RNA viene caricato su
RISC
Viene scelto il filamento
termodinamicamente
meno stabile al 5’
RISC contiene
- contiene una elicasi
che srotola il dsRNA
-endoribonucleasi
responsabile del taglio
sull’mRNA
Fase II: il complesso RISC
• complesso nucleasico-proteico
• contiene una elicasi ed una endoribonucleasi
• si associa all’RNAi
• taglia l’mRNA 11-12 nucleotidi a valle dal 5’ dell’RNAi
• l’mRNA viene successivamente degradato molto probabilmente
da una esonucleasi
• in alcuni organismi i frammenti di mRNA possono essere
convertite in dsRNA da una RNA polimerasi RNA dipendente
(RdRP)
AMPLIFICAZIONE
Amplificazione dell’RNAi
Meccanismo noto in C.elegans, N.crassa, Dictyostelium discoideum,
piante ma non nei mammiferi
RNA-dependent RNA polymerase (RdRP)
• poche molecole di siRNA sono sufficienti per portare alla continua
degradazione dell’mRNA (in piante e C.elegans)
• in estratti embrionali di Drosophila si sono isolati dsRNA completi
generati da siRNA marcati
• sia dsRNA che ssRNAsono utili per funzionare da templato per la
RdRP
• la RdRP richiede siRNA che abbiano P-5’ e OH-3’ per l’amplificazione
• nelle piante e nei nematodi l’effetto di silenziamento si diffonde anche
nelle cellule circostanti, e viene ereditato anche dalla progenie
• in C.elegans la proteina di membrana SID-1 permette il trasporto di
dsRNA da cellula a cellula
E in cellule di mammifero?
Attivazione della proteinchinasi RNA dipendente
P P
dsRNA
PKR
Produzione di
interferone
P
EIF2α
Morte
2’-5’ oligoadenilato
cellulare
sintasi
RNA-seL
Blocco della sintesi proteica
apoptosi
E in cellule di mammifero?
Kumar M, Carmichael GG. “Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes.”
Microbiol Mol Biol Rev (1998) 62:1415-34
E in cellule di mammifero?
• Tuschl e colleghi hanno dimostrato che l’introduzione diretta di dsRNA
di 20 nucleotidi, che simulano i prodotti di degradazione di Dicer, e’
efficiente nel silenziamento e non scatena la risposta dell’interferone
• gli siRNA vengono direttamente incorporati da RISC
• gli siRNA non sono riconosciuti da PKR
• nei mammiferi l’effetto dell’RNAi e’ transiente poiche’ non c’e’
amplificazione
Funzioni biologiche dell’RNAi
Negli animali e nelle piante sono presenti piccoli RNAs di 21-23
nucleotidi, che regolano post-trascrizionalmemte l’espressione di
alcuni geni. Il meccanismo con cui agiscono comprende 2 diversi
pathway: siRNA e stRNA
siRNA (small interfering RNA) quando questi RNA
degradano l’mRNA tramite appaiamento sequenza specifica
stRNA (small temporal RNA) quando bloccano la
traduzione dell’mRNA tramite appaiamento non perfettamente
sequenza-specifico
• abbondanti in tutti i tipi cellulari anche in cellule di
mammifero
• molecole di RNA a singolo filamento ma che si
conformano in strutture ad hairpin a causa di zone
di complementarieta’
• variano da poche centinaia per cellula a 40.000
molecole per cellula
• Vengono codificati dal genoma
• Regolano l’espressione di geni distinti attraverso
appaiamento di basi, inibendo la traduzione in
proteine
• miRNA regolano geni diversi (circa 100
geni/miRNA)
siRNA
Degradazione dell’mRNA
microRNA
Blocco della traduzione
• Il grado di inibizione della traduzione da parte di miRNA dipende da
quante molecole di miRNA sono legate all’mRNA target
• Diversi miRNA possono avere un unico mRNA nella regione al 3’ non
tradotta come target
• non codificano proteine
COSA FANNO I MicroRNA?
-Nei nematodi e nelle piante regolano lo sviluppo
- In Drosophila regolano la divisione cellulare e la morte
cellulare
- Nelle cellule umane regolano l’espressione genica e il
differenziamento cellulare
A seconda del grado di appaiamento con l’mRNA target i
miRNA possono anche portare alla degradazione
- miR-375 (nell’uomo) e’ naturalmente espresso nel pancreas> la sua espressione sopprime la secrezione di insulina
stRNA o microRNA e siRNA
stRNA in C.elegans
Nei nematodi le fasi di sviluppo sono regolate dai geni eterocronici
lin-4 e let-7, che espressi in momenti diversi, controllano il
susseguirsi dello sviluppo larvale
Early
Lin-14
Lin-4
Late
Let-7
Adult
Lin-41
Espressione proteica dei geni eterocronici
Proteina e RNA di lin-14 e lin-4
Studio dei mutanti Lin14gain of function e Lin4 loss of function:non diventano adulti
·Lin-4 ha una
sequenza
complementare
a lin-14
Proteina
Alti livelli di
RNA non si
traducono
in alti livelli
di proteina:
regolazione
dell’mRNA
RNA
10x
·Nel mutante
gain of function
ci sono
mutazioni nella
regione di
formazione del
duplex
·Lin-4 blocca la
traduzione di
lin-14
7 siti di
complementarieta’
tra lin-4 e lin-14
MicroRNA che inibiscono la traduzione
Tra i fenomeni di silenziamento post-trascrizionale
(impiego di ODN e ribozimi) l’RNAi e’ il piu’ efficace nel
bloccare l’espressione di un gene
- Silenziamento prossimo al 100%
- Occorrono basse concentrazioni di interferente
Applicazioni di RNAi
• Ricerca biologica
– Definire funzioni geniche (alternativa al
difficile e laborioso knockout)
• C. elegans genome RNAi projects
– Definire pathways biochimici
• microarray screening di RNAi knockdown su
p53
•
Trattamenti terapeutici
–
–
–
–
–
cancro
Infezioni virali
Infezioni da parassiti
Malattie neurodegenerative
Malattie geniche dominanti
Modalita’ di somministrazione
• siRNA sintetici: facile, si possono provare molti target
contemporaneamente ma costoso, effetto non duraturo
(la durata dipende dal tipo cellulare)
-
Sintesi chimica di nucleotidi ad RNA
Trascrizione in vitro di corti RNA
Trascrizione in vitro di lunghi RNA seguito da taglio con RNA-asiIII
• Vettori a DNA: duraturi, problema dell’integrazione
random
- Plasmidi
- Vettori virali
•Geni RAS frequentemente mutati nel cancro (soprattutto nel cancro
del pancreas 85% e del colon 40%)
•Le proteine codificate dai geni RAS (K-RAS, H-RAS e N-RAS)
regolano proliferazione, differenziamento e sopravvivenza cellulare
trasduzione del segnale
•Mutazioni puntiformi bloccano la proteina oncogenica RAS mutata
in una forma legante GTP persistentemente attivata
•La proteina wild-type e’ essenziale per lo sviluppo dell’organismo
topi nullizigoti per K-Ras muoiono nella fase embrionale
Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA
interference
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R.
Cancer Cell 2002 Sep;2(3):243-7
Come eliminare la funzione dell’allele mutato endogeno K-RasV12?
Carcinoma del
pancreas
L’RNAi K-RASV12 e’ specifico
per l’allele mutato!
Come rendere le cellule che portano l’allele
mutato stabilmente trasfettate con l’interferente
per K-RasV12?
Vettore retrovirale
Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA
interference
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R.
Cancer Cell 2002 Sep;2(3):243-7
Trasfettate con H-Ras oncogene
Le cellule wt non crescono su soft agar
Topi nude iniettati con
CAPAN-1
Grande passo avanti per la terapia
genica
•Specificita’ del target
•Riduce lo sforzo di lavorare sul vettore per
conferire il tropismo per cellule target
•Le cellule “normali” non vengono danneggiate
• Approccio utile non solo per geni con mutazioni
puntiformi ma anche per traslocazioni
cromosomiche